大孔樹脂-磁場輔助溶劑結晶聯合純化紅松籽油甾醇的研究

王莉莉，包怡紅，趙慶佳，張 娜，郭慶啟,3

(東北林業大學林學院1，哈爾濱 150040) (哈爾濱商業大學食品工程學院2，哈爾濱 150028) (黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室3，哈爾濱 150040)

植物甾醇屬于三萜烯化合物[1]，通常以游離甾醇或者由甾醇酯、甾醇糖苷和酰基化甾醇糖苷構成的結合甾醇形式廣泛存在于各種堅果、種子和植物油中[2,3]，其主要為豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇以及飽和形式的甾烷醇。國內外研究發現，植物甾醇具有降血脂[4]、預防心血管疾病[5]、抗腫瘤[6]以及減肥[7]等作用，在食品、醫藥及化妝品等領域得到廣泛應用。

目前有關植物甾醇提取的研究較多，主要有皂化法、超臨界CO2萃取法、層析法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[8-11]，來源于油脂的植物甾醇粗提物因含有色素、脂肪酸等使其黏度較大，影響了其純度、功能以及綜合利用。對于植物甾醇純化的相關研究文獻報道較少，甾醇類活性物質的純化研究常采用分子蒸餾法、大孔樹脂法、溶劑結晶法等，分子蒸餾法是在高真空條件下利用料液中分子蒸發速率的不同進行分離，此法操作復雜且物質的回收率較低[12]，大孔樹脂法操作簡便、純化效率高，環保可重復利用[13]，溶劑結晶法即利用活性物質在某一溶劑中溶解度的不同從而使溶質達到過飽和狀態而結晶析出，提高物質純度，但需多次結晶后才可獲得純度較高的植物甾醇[14]；磁場輔助溶劑結晶即將傳統的結晶過程置于磁場環境中，借助磁場強度、時間和方向作用對分子和原子的聚集狀態、遷移速度和方向產生影響，增加物質間的碰撞機會，通過對結晶過程進行調控，有助于改善甾醇溶液的黏度、溶解度和表面張力，實現促進晶核形成和改善晶體品質的目的。Gavira等[15]實驗表明在磁場條件下會影響溶菌酶四方晶體的成核和生長，許凱云等[16]利用磁場誘導結晶分離薄荷醇堿，發現在磁場作用下結晶時間由10 h縮短至4 h。

本研究以紅松籽油甾醇提取物為原料，以吸附率和解吸率為指標，篩選最佳樹脂型號，通過靜態及動態吸附與解吸實驗，確定大孔樹脂純化紅松籽油甾醇的最適工藝條件；再以純度和結晶率為指標，二次分離純化紅松籽油甾醇，確定純化工藝參數；最后通過光譜、氣-質等技術對紅松籽油甾醇的結構和組成進行表征和鑒定，以期為紅松籽油甾醇的制備及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松(PineskoraiensisL.)籽、膽固醇標準品(純度≥98%)、溴化鉀(光譜純)、甲醇(色譜純)。

1.2 儀器與設備

TU1900紫外-可見分光光度計，Scientz-18N 冷凍干燥機，IS-RSDS臺式恒溫振蕩器，DCT 23-15 可調式電磁鐵，HT20 高斯計，FTIR-480 傅里葉變換紅外光譜儀，7890-5973N 氣質聯用儀。

1.3 方法

1.3.1 紅松籽油甾醇提取物的制備

參考劉海霞等[9]方法制備紅松籽油甾醇粗提物。

1.3.2 紅松籽油甾醇含量與純度的測定

采用磷硫鐵顯色法進行甾醇含量的測定[17]，樣品紅松籽油甾醇含量以膽固醇質量計，mg/mL。以膽固醇質量濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，方程為y=4.910 5x-0.000 7，R2=0.999。按式(1)計算甾醇純度。

(1)

式中：C為紅松籽油甾醇含量/mg/mL；V為紅松籽油甾醇溶液體積/mL；m為紅松籽油甾醇質量/mg。

1.3.3 大孔樹脂初次純化紅松籽油甾醇的研究1.3.3.1 大孔樹脂的篩選

取預處理后的樹脂2.00 g，加入30 mL紅松籽油甾醇提取液(0.15 mg/mL)，120 r/min、25 ℃振蕩吸附12 h后過濾，測定吸附液中紅松籽油甾醇含量。將樹脂用蒸餾水洗凈，用濾紙吸干水分，加入30 mL無水乙醇溶液，120 r/min、25 ℃振蕩12 h后過濾，測定解吸液中紅松籽油甾醇含量，按照式(2)～式(4)分別計算甾醇的吸附率、吸附量和解吸率。

(2)

(3)

(4)

式中：C0為紅松籽油甾醇初始含量/mg/mL；C1為吸附液中紅松籽油甾醇含量/mg/mL；C2為解吸液中紅松籽油甾醇含量/mg/mL；V1為吸附液體積/mL；V2為解吸液體積/mL；m1為樹脂的質量/g。

1.3.3.2 AB-8樹脂對紅松籽油甾醇靜態吸附及解吸動力學研究

取AB-8樹脂2.00 g，加入30 mL甾醇提取液，120 r/min、25 ℃振蕩吸附12 h，每1 h測定吸附液中甾醇含量。吸附結束后，過濾，將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗凈，加入30 mL無水乙醇進行解吸，于120 r/min、25 ℃振蕩解吸12 h，每1 h測定解吸液中甾醇含量。

1.3.3.3 AB-8樹脂靜態/動態吸附及解吸對甾醇純化效果影響的研究

取2.00 g AB-8樹脂濕法上柱，考察甾醇上樣質量濃度、乙醇體積分數、吸附流速、甾醇上樣量、解吸流速、解吸液體積對紅松籽油甾醇純化效果的影響。

1.3.4 磁場輔助溶劑結晶二次純化紅松籽油甾醇的研究

將大孔樹脂純化的紅松籽油甾醇初次純化液在45 ℃條件下真空旋轉蒸發，真空冷凍干燥。稱取一定質量的紅松籽油甾醇，按一定料液比加入結晶溶劑，回流加熱至溶解，趁熱過濾，冷卻至室溫。室溫條件下在固定磁場強度的磁場中結晶1 h，置于某一溫度下養晶一段時間，過濾，取少量溶劑沖洗濾渣，濾渣烘干后密封保存。考察結晶溶劑、料液比、養晶溫度、養晶時間對紅松籽油甾醇純化效果的影響，按式(1)、式(5)計算紅松籽油甾醇純度和結晶率。

(5)

式中：m3為稱取的大孔樹脂純化后的甾醇質量/g；m4為結晶后的甾醇質量/g；P1為大孔樹脂純化后甾醇的純度/%；P2為結晶后甾醇的純度/%。

1.3.5 紅松籽油甾醇的鑒定分析

1.3.5.1 紅松籽油甾醇的紫外-可見光譜掃描分析

取少量紅松籽油甾醇，用甲醇溶解，利用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描，確定最大吸收波長。

1.3.5.2 紅松籽油甾醇的紅外光譜掃描分析

稱量干燥后的紅松籽油甾醇樣品1 mg，稱取烘干后的KBr 100 mg，研磨混合均勻后，壓片，采用紅外光譜透射法進行掃描。

1.3.5.3 紅松籽油甾醇的GC-MS鑒定分析

樣品前處理方法參考彭麗霞等[17]的方法。GC條件：DB-5 ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度為260 ℃；載氣為He，分流進樣，分流比為30∶1；恒定流速1 mL/min，采用升溫程序，初始溫度230 ℃保持2 min；以2 ℃/min升至250 ℃，保持45 min。

MS條件：接口溫度280 ℃，溶劑延遲3 min，EI離子源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四級桿溫度150 ℃，質量掃描范圍50～500 amu。

1.4 數據統計與分析

數據結果采用平均值±標準差表示，使用SPSS 24.0、Excel 2010與Origin 2018軟件進行圖表繪制及數據分析。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂靜態吸附及解吸實驗對紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.1.1 大孔樹脂型號對紅松籽油甾醇純化效果的影響

根據極性不同選取了NKA-9(極性)、NKA-Ⅱ(極性)、AB-8(弱極性)、D-101(非極性)、S-8(非極性)5種大孔樹脂純化紅松籽油甾醇，其純化效果如表1所示。AB-8和D-101樹脂的吸附能力較強，NKA-9的吸附效果最差，D-101樹脂的解吸率顯著低于AB-8(P<0.05)。張冬陽等[18]利用AB-8、D-101、DA-201樹脂純化薏米中β-谷甾醇，發現AB-8樹脂對β-谷甾醇的純化具有顯著效果，大孔樹脂的吸附與解吸能力與其本身的極性、比表面積和孔隙結構有關，因此選擇AB-8樹脂純化紅松籽油甾醇。

表1 大孔樹脂靜態吸附與解吸效果

2.1.2 靜態吸附時間與甾醇濃度對紅松籽油甾醇純化效果的影響

吸附時間與甾醇濃度對紅松籽油甾醇純化效果的影響結果如圖1所示。AB-8樹脂在吸附紅松籽油甾醇過程中，吸附率隨時間的增加呈先升高后平緩的趨勢，在0～3 h范圍內吸附率快速上升，3 h后樹脂吸附趨于平衡，表明AB-8樹脂可快速吸附紅松籽油甾醇，3 h內達到吸附基本達到飽和，故選擇吸附時間為3 h。

紅松籽油甾醇溶液因含有較多色素和脂肪酸，上樣質量濃度越高雜質含量越大，溶液黏度增大，會爭奪AB-8樹脂中的活性位點，增加樹脂對雜質的吸附效果，占據樹脂空隙，導致甾醇吸附率降低。當紅松籽油甾醇上樣質量濃度較低時所含甾醇含量較小，吸附動力小，吸附率低。合適的上樣質量濃度使紅松籽油甾醇與樹脂充分接觸，提高樹脂利用率，故選擇紅松籽油甾醇的上樣質量濃度為0.2 mg/mL。

注：圖中小寫字母的不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 吸附時間與甾醇濃度對紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.1.3 靜態解吸時間與乙醇體積分數對紅松籽油甾醇純化效果的影響

解吸時間與乙醇體積分數對紅松籽油甾醇純化效果的影響結果如圖2所示。解吸是為了將吸附在樹脂中的紅松籽油甾醇分離出來，而解吸液是一種更易與大孔樹脂相結合的物質，可以減弱樹脂與紅松籽油甾醇的相互作用力，使紅松籽油甾醇更易釋放出來。在0～4 h范圍內，紅松籽油甾醇的解吸率快速上升，4 h后達到平衡，此后解吸率變化趨于平穩，因此選擇解吸時間為4 h。

乙醇體積分數在50%～80%范圍內，解吸率隨乙醇體積分數的增大而增大，大孔樹脂遵循相似相溶原則，AB-8樹脂屬于弱極性樹脂，樹脂的吸附性與范德華力和氫鍵有關，極性越相似范德華力越大[19]，乙醇的體積分數越小，極性越大，不利于紅松籽油甾醇的解吸，乙醇體積分數越大，極性變弱，接近AB-8樹脂的極性，故解吸效果越強[20]。當乙醇體積分數大于80%時，醇溶性雜質被解吸出來，導致紅松籽油甾醇的解吸率下降，故選擇體積分數80%的乙醇溶液解吸紅松籽油甾醇。

圖2 解吸時間與乙醇體積分數對紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.2 動態吸附及解吸實驗對紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.2.1 吸附流速與解吸流速對紅松籽油甾醇純化效果的影響

吸附流速與解吸流速對紅松籽油甾醇純化效果的影響，結果如圖3。合適的吸附流速節省時間同時可提高效率，吸附流速為2 mL/min時吸附率最大(P<0.05)，為(88.44±3.52)%，吸附流速較慢時，紅松籽油甾醇可與樹脂充分接觸，擴散至樹脂孔隙內部，但試驗周期長效率低，吸附流速快，樹脂與紅松籽油甾醇作用時間短，導致紅松籽油甾醇未被吸附便已泄漏[21]，因此選擇吸附流速為2 mL/min。

圖3 吸附流速與解吸流速對紅松籽油甾醇純化效果的影響

解吸流速越快，導致乙醇溶液未充分擴散至樹脂內部便已流出，并未溶解出紅松籽油甾醇，故解吸效果差，而解吸流速較慢時，醇溶性雜質被帶出，純化效果不佳，實驗時間長[22]，因此選擇解吸流速為2 mL/min。

2.2.2 紅松籽油甾醇上樣量對純化效果的影響

甾醇上樣質量濃度為0.2 mg/mL，以2 mL/min流速收集流出液，每5 mL 為一個流分，測定每個流分中的甾醇含量，以泄漏點為指標，泄漏曲線如圖4所示。以流出液中紅松籽油甾醇的質量濃度達到上樣液中紅松籽油甾醇質量濃度的十分之一為泄漏點[23]，當流出液中甾醇的濃度達到泄漏點時，表明樹脂已吸附飽和。第6個流分中紅松籽油甾醇質量濃度為0.023 mg/mL，即上樣量為30 mL時，紅松籽油甾醇已達到泄漏點，上樣量較小，樹脂不能充分利用，未吸附紅松籽油甾醇的樹脂活性位點易被雜質占據，導致純化效果下降[24]；上樣量較大，樹脂吸附飽和后造成原液中紅松籽油甾醇大量流失，故選擇30 mL為紅松籽油甾醇的最佳上樣量。

圖4 泄漏曲線

2.2.3 解吸液體積對紅松籽油甾醇純化效果的影響

取2.00 g吸附飽和的樹脂，用80%乙醇溶液以2 mL/min解吸，每5 mL為一個流分，測定每個流分中紅松籽油甾醇含量，解吸液體積對紅松籽油甾醇純化效果的影響見圖5。解吸液體積較小不能完全洗脫出紅松籽油甾醇，解吸液體積較大，溶劑消耗大，且后期溶劑去除困難。第14個流分中紅松籽油甾醇基本已經全部解吸出來，之后隨著乙醇溶液的增加，紅松籽油甾醇含量不再變化，最終紅松籽油甾醇質量濃度降至0.01 mg/mL并趨于平穩，故選擇解吸液體積為70 mL。

本研究中，大孔樹脂純化紅松籽油甾醇的最佳工藝：選擇AB-8樹脂、上樣質量濃度0.2 mg/mL，上樣量30 mL，吸附流速2 mL/min，吸附時間3 h，解吸液乙醇體積分數80%，乙醇體積70 mL，解吸流速2 mL/min，解吸時間4 h，此條件下紅松籽油甾醇純度為(45.32±2.13)%。

圖5 洗脫曲線

2.3 磁場輔助溶劑結晶二次純化紅松籽油甾醇的研究

2.3.1 結晶溶劑對紅松籽油甾醇純化效果的影響

稱取紅松籽油甾醇，加入不同結晶溶劑，輕微加熱直至甾醇全部溶解，冷卻至室溫，置于磁場中結晶，當溶液中甾醇含量不再變化時表明結晶結束，養晶溫度-7 ℃，養晶時間5 h條件下，結晶溶劑對紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖6、圖7所示。利用高斯計測定磁場強度為0.3 T，磁場可促進晶體的成核速率，加快晶體生長速度。純度較高的植物甾醇為白色晶體，粗甾醇因含有色素及脂肪酸，使其黏度較大為黃色膏狀體，不宜使用活性炭脫色，經大孔樹脂純化后的紅松籽油甾醇呈淡黃色，故使用有機溶劑繼續來萃取色素和脂肪酸。

圖6 不同溶劑中紅松籽油甾醇結晶效果圖

注：純度之間差異顯著性(P<0.05)用不同小寫字母表示；結晶率之間差異顯著性(P<0.05)用不同大寫字母表示；下同。圖7 結晶溶劑對紅松籽油甾醇純化效果的影響

不同溶劑中紅松籽油甾醇結晶效果如圖6所示，紅松籽油甾醇在無水乙醇中結晶顆粒顏色為白色，而在其他4種溶劑中結晶顆粒表面泛黃，在異丙醇中結晶顆粒粗大，在正己烷中呈絮狀，在無水乙醇和丙酮中結晶顆粒較為均勻，且結晶速度較快，在甲醇中結晶顆粒細小而輕薄。由圖7可知異丙醇和無水乙醇作為結晶溶劑時，紅松籽油甾醇的純度差異不顯著，但異丙醇的結晶率較低，而無水乙醇和丙酮的結晶率較高，可能是植物甾醇在丙酮試劑中溶解度變化較大，析出晶體較多，但丙酮結晶出的甾醇純度較低，故選擇無水乙醇為結晶溶劑。以無水乙醇為結晶溶劑，無磁場條件下紅松籽油甾醇結晶率為(30.39±0.54)%，純度為(54.25±2.13)%，對比表明，磁場輔助溶劑結晶純化紅松籽油甾醇可使其純度提高20.86%。

2.3.2 料液比對紅松籽油甾醇純化效果的影響

以無水乙醇為結晶溶劑，養晶溫度-7 ℃，養晶時間5 h時，料液比對紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖8所示。

圖8 料液比對紅松籽油甾醇純化效果的影響

當料液比為1∶10 時紅松籽油甾醇的純度和結晶率均最大(P<0.05)，在結晶體系中，料液比越大過飽和度越小，晶核更易于形成，晶體依附晶核生長，形態較好且純度更高，但因晶體生長緩慢，甾醇結晶率較低。料液比越小，飽和度越大，體系傳質阻力增大，晶體不規則生長且速率加快，結晶率升高，但不規則生長會包裹雜質導致純度降低[25]。

2.3.3 養晶溫度對紅松籽油甾醇純化效果的影響

以無水乙醇為結晶溶劑，料液比1∶10 ，養晶時間5 h時，養晶溫度對紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖9所示。

養晶溫度為5 ℃時，紅松籽油甾醇的純度(80.48±2.10)%及結晶率(35.00±0.90)%均最大(P<0.05)，溫度為-18 ℃，雜質析出較多，純度為(53.65±1.52)%。田燕等[26]研究表明0 ℃左右各種甾醇均會結晶析出，而室溫或高于室溫，高純度的谷甾醇結晶析出，但得率低。彭超等[27]均在5 ℃條件下結晶，植物甾醇純度為97.72%。

圖9 養晶溫度對紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.3.4 養晶時間對紅松籽油甾醇純化效果的影響

以無水乙醇為結晶溶劑，料液比1∶10，養晶溫度5 ℃，養晶時間對紅松籽油甾醇純化效果的影響如圖10所示。

紅松籽油甾醇的結晶率和純度都隨著時間延長呈先升高后下降的趨勢，養晶時間4 h純度(83.12±2.10)%和結晶率(39.00±0.51)%最大(P<0.05)，之后隨時間延長，晶核表面附著雜質越多，純度明顯降低，田燕等[26]認為養晶時間長會降低生產效率，不利于實際生產，因此選擇養晶時間為4 h。

因此，利用磁場輔助溶劑結晶二次純化紅松籽油甾醇的最佳工藝為：磁場強度0.3 T，無水乙醇為結晶溶劑，料液比1∶10 ，養晶溫度5 ℃，養晶時間4 h。此條件下紅松籽油甾醇純度為(83.12±3.24)%。

圖10 養晶時間對紅松籽油甾醇純化效果的影響

2.4 紅松籽油甾醇的結構鑒定

2.4.1 紅松籽油甾醇紫外-可見光譜掃描分析

利用甲醇將粗甾醇和二次純化后的紅松籽油甾醇溶解，于紫外-可見分光光度計進行掃描，所得圖譜如圖11所示，紅松籽油甾醇純化物的甲醇溶液在211 nm處有1個強吸收峰，粗提物在212 nm處有1個強吸收峰，符合植物甾醇的特征吸收峰[28]，粗提物可能含有雜質，使曲線有拖尾現象。

圖11 紅松籽油甾醇的紫外吸收曲線

2.4.2 純化后紅松籽油甾醇的紅外光譜掃描分析

植物甾醇是以環戊烷多氫菲(3個環己烷和1個環戊烷稠合而成)為骨架及3個側鏈而構成，R1和R2一般為甲基，R3一般為多碳鏈構成，且C3位為羥基。二次純化后的紅松籽油甾醇的紅外光譜掃描結果如圖12所示，3 341 cm-1處有譜帶較寬的羥基(—OH)振動峰，2 941 cm-1為甲基(—CH3)振動峰，2 868 cm-1為亞甲基(—CH2)振動峰，1 464 cm-1為甲基或亞甲基的不對稱變形振動峰，1 376 cm-1為甲基的對稱變形振動峰，1 058 cm-1為羥基鍵的變形振動峰，960 cm-1反式二取代烯烴的彎曲振動峰，839 cm-1為三取代烯烴的彎曲振動峰，800 cm-1為C—C單鍵伸縮振動峰，均符合植物甾醇的特征吸收峰[29]，而在1 750～1 725 cm-1處無明顯的酯基振動峰，表明與脂肪酸相連的甾醇已完全游離出來。

圖12 紅松籽油甾醇的紅外分析圖譜

2.4.3 純化后紅松籽油甾醇種類及含量分析

以膽固醇為內標物，采用GC-MS對紅松籽油甾醇種類及含量進行分析，內標法計算甾醇含量。結果如圖13所示。保留時間為28.19、32.75、39.43、40.99 min的峰分別為芝麻素、菜油甾醇、β-谷甾醇、16-α-羥基孕甾烯醇酮，其含量分別為(7.13±0.15)、(33.37±0.13)、(153.12±0.24)、(53.38±0.16)mg/100 g，紅松籽油甾醇總量為186.49 mg/100 g，且以β-谷甾醇為主。朱雪梅等[30]測得松籽油甾醇含量為141.64 mg/100 g。徐鑫等[31]測得松籽油甾醇含量為207.66 mg/100 g，菜油甾醇和谷甾醇分別為40.265、167.397 mg/100 g。

注：1～5分別表示膽固醇、芝麻素、菜油甾醇、β-谷甾醇、16-α-羥基孕甾烯醇酮。圖13 紅松籽油甾醇的GC-MS總離子圖

3 結論

采用5種大孔樹脂對紅松籽油甾醇進行初步純化，結果表明AB-8樹脂更適用于紅松籽油甾醇的純化，在本實驗最佳純化工藝下，紅松籽油甾醇純度為(45.32±2.13)%。利用磁場輔助溶劑結晶法進行二次純化后，紅松籽油甾醇的純度為(83.12±3.24)%。紅松籽油甾醇經紫外-可見光譜掃描，在210 nm波長左右處有最大吸收峰，利用紅外光譜掃描，在3 341、2 941、2 868、1 376、1 058、960、839、800 cm-1處出現了植物甾醇的特征吸收峰，經GC-MS鑒定出紅松籽油中的2種植物甾醇，分別為β-谷甾醇和菜油甾醇，且β-谷甾醇占甾醇總量的80%以上。結果表明，采用大孔樹脂聯合磁場輔助溶劑結晶法可以有效的對紅松籽油甾醇進行純化，今后可進一步研究純化后紅松籽油甾醇的功能性質以及磁場對結晶效果影響機理。