基于含量測定和化學計量法的地骨皮多指標成分分析

王亞飛，楊平榮，，楊耘，宋平順，倪琳

1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省藥品檢驗研究院，國家食藥監局中藥材中藥飲片質量重點控制實驗室，甘肅省中藏藥檢驗檢測技術工程實驗室，甘肅省中藥品質與安全評價工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省婦幼保健院藥學部，甘肅 蘭州 730000

地骨皮為茄科植物枸杞Mill.或寧夏枸杞L.的干燥根皮，主產于山西、河北、河南、甘肅、寧夏及華北等地，味甘、性寒，歸肺、肝、腎經，有涼血除蒸、清肺降火功效，主要用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血及內熱消渴等。現代藥理學研究發現，地骨皮具有降低血糖、降血壓、解熱鎮痛、免疫調節、抗菌等作用。地骨皮的主要成分包括黃酮、有機酸、多肽類、甾醇、香豆素和揮發油，然而地骨皮的有效成分尚不明確，2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）未規定含量測定項。

地骨皮甲素和地骨皮乙素為精胺生物堿，具有糾正免疫紊亂、降血壓、保護NMDA誘導的原代神經元損傷等作用。阿魏酸、咖啡酰丁二胺、N-反式阿魏酰酪胺、綠原酸和肉桂酸等為酚酰胺類和酚酸類化合物。酚酰胺類和酚酸類化合物具有降血壓、抗炎、抗氧化和保護小膠質細胞等藥理活性。東莨菪亭為香豆素類化合物，香豆素類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗炎、退熱、鎮靜等。本研究采用HPLC對不同產地的42批地骨皮進行研究，建立地骨皮中8種化學成分含量測定的方法，并采用主成分分析、聚類分析和偏最小二乘判別分析等化學計量學方法進行分析，為地骨皮的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國Waters公司，型號ACQUITYARC），電子天平（德國賽多利斯公司，型號QUINTIX224-1CN、secura125-1cn），Synergi 4u Hydro-RP80A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

地骨皮甲素（批號W01N9Z73848），上海源葉生物科技有限公司，含量≥98%；地骨皮乙素（批號P25F11F108939），上海源葉生物科技有限公司，含量≥98%；咖啡酰丁二胺（批號DST200512-015），成都德思特生物技術有限公司，含量≥98%；綠原酸（批號110753-201817），中國食品藥品檢定研究院，含量以96.8%計；東莨菪亭（批號BP1275），成都瑞芬思生物科技有限公司，純度＞98%；阿魏酸（批號110773-201915），中國食品藥品檢定研究院，含量以99.4%計；N-反式阿魏酰酪胺（批號WK920033108），四川省維克奇生物科技有限公司，含量≥98%；肉桂酸（批號110786-201604），中國食品藥品檢定研究院，含量以98.8%計。乙腈（批號JA106730），美國supelco公司，色譜純；三氟乙酸（批號G2023076），阿拉丁試劑（上海）有限公司，色譜純；超純水（批號SC10613102200012），屈臣氏。

地骨皮樣品共42批，本實驗室于2019－2021年采集，經甘肅省藥品檢驗研究院馬瀟主任鑒定為茄科植物枸杞Mill.或寧夏枸杞L.的干燥根皮，產地信息見表1。

表1 42批地骨皮樣品產地信息

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 對照品溶液制備

分別取咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1 mL含咖啡酰丁二胺0.51 mg、綠原酸6.97 mg、地骨皮乙素10.68 mg、地骨皮甲素2.03 mg、東莨菪亭0.03 mg、阿魏酸0.03 mg、肉桂酸0.01 mg、N-反式阿魏酰酪胺0.01 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備

取樣品粉末（過3號篩）約1.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，過濾后將濾液蒸干，殘留物用甲醇溶解，定容至2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件

采用Synergi 4u Hydro-RP80A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.5%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，10%A；3～20 min，10%～11%A；20～30 min，11%～12%A；30～50 min，12%～14%A；50～60 min，14%～16%A；60～70 min，16%～18%A；70～80 min，18%～10%A），柱 溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測波長278 nm。理論塔板數按阿魏酸峰計算應不低于5000。色譜圖見圖1。

圖1 地骨皮中8種成分HPLC圖

2.1.4 線性關系考察

精密取各對照品適量，加甲醇溶解，配制成每1 mL含咖啡酰丁二胺3.01 mg、綠原酸35.88 mg、地骨皮乙素20.15 mg、地骨皮甲素4.12 mg、東莨菪亭0.15 mg、阿魏酸0.13 mg、肉桂酸0.04 mg、N-反式阿魏酰酪胺0.04 mg的混合對照品貯備液，分別精密吸取上述混合對照品貯備液，用甲醇稀釋成1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣，以各對照品峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，8種成分的回歸方程、相關系數及線性范圍見表2，表明各成分在各自線性范圍內線性關系良好。

表2 8種成分線性關系考察結果

2.1.5 精密度試驗

分別吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣6次，每次10 μL，測得咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺峰面積RSD分別為0.78%、0.45%、0.67%、1.43%、0.97%、0.49%、1.78%、2.01%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗

精密稱取地骨皮藥材粉末，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣，測得咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺含量的RSD分別為1.36%、1.75%、0.35%、0.78%、1.23%、1.66%、1.29%、1.37%，表明該方法重復性好。

2.1.7 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12 h進樣10 μL，測得咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、地骨皮甲素、東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺峰面積的RSD分別為1.28%、1.05%、1.92%、1.73%、0.29%、1.34%，表明供試品在12 h內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密稱取各成分含量已知的樣品（22號）粉末18份，每份約0.75 g（分別含咖啡酰丁二胺0.79 mg、綠原酸8.48 mg、地骨皮乙素13.47 mg、地骨皮甲素3.00 mg、東莨菪亭0.035 mg、阿魏酸0.031 mg、肉桂酸0.006 mg和N-反式阿魏酰酪胺0.002 mg），分為3組，分別加入各成分含量已知的高（120%）、中（100%）、低（80%）濃度混合對照品溶液1 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣，計算加樣回收率，結果見表3。

表3 8種成分加樣回收率試驗結果（n=6）

2.1.9 樣品含量測定

取不同產地樣品粉末（過3號篩）各約1.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，分別記錄8種成分的峰面積，以外標法計算各成分含量，結果見表4。可以看出，地骨皮樣品中8種成分的含量跨度均較大，故采用化學計量學方法對不同產地地骨皮樣品中8種成分含量數據進行分析。

表4 地骨皮樣品中8種成分含量測定結果（mg/g，n=3）

2.2 化學計量學分析

2.2.1 聚類分析

運用SPSS25.0統計軟件對不同產地地骨皮8種成分含量進行聚類分析。以平方歐氏距離計算，連接方法為平均聯接，不同產地地骨皮中8種成分含量的系統聚類分析結果見圖2。可以看出，不同產地的地骨皮可以被較好地分開。當類間距離為12～25時，樣品可分為兩類：一類為甘肅、寧夏、河北樣品，一類為安徽、湖北樣品。當類間距離為5時，樣品可分為4類：一類為甘肅樣品，一類為安徽樣品，一類為湖北樣品，最后一類包含甘肅、寧夏和河北樣品；當類間距離為2時，該類樣品可獨立分為甘肅、寧夏、河北樣品。除6號和36號樣品外，其余40批樣品的聚類結果均與產地具有良好相關性。

圖2 不同產地地骨皮樣品8種成分含量系統聚類分析

2.2.2 各成分含量散點

運用Graphpad Prism 8軟件繪制不同產地地骨皮樣品中8種成分含量的散點圖，結果見圖3。可直觀看出不同產地地骨皮各成分含量的差異。其中，咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素和地骨皮甲素4種成分的含量隨產地的變化較為明顯：甘肅、寧夏和河北的樣品含量相近且較低，安徽的樣品含量高于甘肅、寧夏和河北，湖北的樣品含量最高。東莨菪亭、阿魏酸、肉桂酸和N-反式阿魏酰酪胺4種成分含量的產地差異不明顯，除個別樣品外，其余含量均較在小范圍內波動。表明在本試驗所測定的8種成分中，前4種成分與產地相關性較強。

圖3 不同產地地骨皮樣品8種成分含量散點（mg/g）

2.2.3 主成分分析

運用SPSS25.0和SIMCA13.0軟件進行主成分分析（PCA），結果見圖4。可以看出，除寧夏和湖北的樣品有部分重疊之外，其他幾個產地的地骨皮可較好分開。采用最大方差法對特征值及因子載荷矩陣進行旋轉解輸出，結果見表5、表6。依據表5的特征值和貢獻率分析，前3個特征值均大于1，且分別代表了變量總方差的45.329%、17.868%、13.586%，累計貢獻率達76.782%，可以代表地骨皮的整體信息，客觀反映了樣品的內在質量，故選擇前3個主成分因子進行分析。由表6可知，主成分1中咖啡酰丁二胺、綠原酸和地骨皮乙素的貢獻值較大，主成分2中肉桂酸的貢獻值較大，主成分3中阿魏酸的貢獻值較大。

圖4 不同產地地骨皮樣品PCA散點

表5 不同產地地骨皮樣品PCA特征值和貢獻率

表6 不同產地地骨皮樣品PCA旋轉變換后的因子載荷矩陣

2.2.4 偏最小二乘判別分析

運用SIMCA13.0軟件進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），建立監督模式識別方法的PLS-DA模型。模型共提取3個主成分，X矩陣解釋率RX為0.717，模型穩定性參數RY為0.384，模型預測能力參數Q為0.15，表明所建的PLS-DA模型解釋率和預測率一般。設置分類Y矩陣變量隨機排列200次做置換檢驗，結果見圖5。R擬合直線在Y軸的截距為0.0735＜0.3，Q擬合直線在Y軸的截距為-0.211＜0.05，說明所建模型可靠，不存在過度擬合現象。PLS-DA散點見圖6。可以看出，42批樣品僅有3批不在95%置信區間內，除寧夏和河北樣品有部分重疊外，其余產地樣品均可明顯區分。變量重要性投影（VIP）可直觀體現各元素引起樣品差異的權重大小，元素VIP值＞1表明其對樣品分類結果權重影響率＞50%，即對分類結果影響具有統計學意義，為差異標志物。8種成分VIP見圖7。42批地骨皮的差異標志成分為綠原酸、地骨皮甲素、咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和東莨菪亭。

圖5 不同產地地骨皮樣品PLS-DA置換檢驗

圖6 不同產地地骨皮樣品PLS-DA散點

圖7 不同產地地骨皮樣品8種成分VIP

3 討論

本試驗比較了不同類型的C18柱對地骨皮成分的分離效果，普通的C18柱對地骨皮甲素、地骨皮乙素等成分分離效果較差，飛諾美的C18端基封尾柱對地骨皮中各成分分離效果較好。此外，本試驗采用不同比例的甲醇為提取溶劑在同一提取方法下進行提取，發現甲醇提取的樣品中各峰面積相對較高；比較了不同提取方法（超聲法、熱回流法、冷浸法）下的提取率和色譜峰情況，發現熱回流法提取的色譜峰基線較平穩且峰面積相對較高；比較了不同波長下各物質的吸收峰，發現在278 nm波長處各物質均具有較強的吸收。所以采用上述各項最佳條件作為最終試驗條件。

在本試驗的提取條件和色譜條件下，咖啡酸和香草酸均有較好的提取率和紫外吸收，但因為咖啡酸和香草酸在此液相條件下出峰時間幾乎相同，故試驗中將這2種成分刪去。今后可通過優化液相條件，將咖啡酸和香草酸作為檢測指標。

本研究建立PLS-DA模型對不同產地地骨皮樣品進行分析，模型預測參數＜0.5，但依據散點圖可知，除寧夏和河北兩地樣品有重疊外，甘肅、湖北和安徽的樣品均能被較好地判別，所以該模型仍可在本試驗涵蓋范圍內被用于未來地骨皮樣品產地的初步判別或依據產地初步估算地骨皮中多種成分的大致含量。

趙曉玲等測定了不同來源地骨皮中地骨皮甲素、地骨皮乙素以及阿魏酸的含量，但因為對照品濃度以及測定條件等原因，作者將地骨皮甲素和地骨皮乙素作為同一指標進行了檢測。蘇磊等測定了地骨皮中咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和綠原酸的含量。張華磊等測定了地骨皮中東莨菪內酯的含量。本試驗在相關研究基礎上，對試驗條件進行了探索和優化，建立了同時測定地骨皮中8種化學成分含量的方法，選取5個省份的樣品進行檢測，并對結果進行了多種化學計量學分析，結果表明對產地影響較大的主成分為咖啡酰丁二胺、綠原酸、地骨皮乙素、肉桂酸和阿魏酸5種；42批地骨皮樣品依據產地分類，其差異標志成分為綠原酸、地骨皮甲素、咖啡酰丁二胺、地骨皮乙素和東莨菪亭5種。在PCA和PLS-DA中，除寧夏和河北兩地的樣品有部分重疊外，其余產地的地骨皮樣品分類效果均較好。

本試驗建立HPLC方法同時對地骨皮中8種成分的含量進行測定，該方法可用于地骨皮藥材質量的全面評價。結合化學計量學分析可知不同產地的地骨皮藥材存在較明顯質量差異，所以地骨皮藥材的產地溯源是必要的。但本試驗收集的地骨皮樣品產地僅有5個省份，而對河南、山西等主要產區未涉及，今后需進一步拓寬樣品產地。本試驗對甘肅、安徽和湖北三地的樣品分類效果較好，寧夏和河北樣品存在部分重疊，提示所測定的8種成分并非不同產地樣品的全部差異性數據，對于不能較好區分產地的樣品，可進一步研究其無機元素含量、紅外光譜等以進行區分。