基于代謝組學(xué)的幼齡大鼠血尿濕熱證隨時(shí)間變化規(guī)律的研究

王元元 劉曉鷹 李 卉 羅接紅 陳 暢 王林群 張雪榮 霍文麗 陳雪蓮

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，武漢，430065； 2 湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢，430061； 3 武漢市兒童福利院，武漢，430061)

兒童血尿涉及多種疾病，其病理改變主要為IgA腎病。研究發(fā)現(xiàn)45.25%病理表現(xiàn)為Ⅲ～Ⅴ級(jí)，15%～40%可發(fā)展為終末期腎衰竭[1]。小兒血尿是否需要治療以及何時(shí)治療，中西醫(yī)認(rèn)識(shí)各異。西醫(yī)常建議長(zhǎng)期隨訪，待出現(xiàn)蛋白尿或腎臟病理改變到一定程度再予以治療[2]。中醫(yī)多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為濕熱傷絡(luò)是其早期病機(jī)，主張積極治療，但因無(wú)臨床癥狀而單以尿檢為用藥依據(jù)，缺乏中醫(yī)證的微觀指標(biāo)[3]。如何準(zhǔn)確選擇小兒血尿的治療時(shí)機(jī)，是臨床中、西醫(yī)都不可回避的難題。目前公認(rèn)腎活檢是腎臟疾病診斷金指標(biāo)，但因有創(chuàng)且存在并發(fā)癥，受醫(yī)療及患者自身?xiàng)l件限制，而重復(fù)活檢更難被接受。所以臨床亟須一類(lèi)理想的指標(biāo)，既敏感精確、無(wú)創(chuàng)易采集，又能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腎臟早期病理變化，即使在不做腎活檢前提下，也能提示病情是否進(jìn)入腎臟病變的進(jìn)展階段。這樣，臨床醫(yī)師確定對(duì)小兒血尿治療的時(shí)機(jī)時(shí)就有了參考。代謝組學(xué)屬于系統(tǒng)生物學(xué)，可使人體生理病理狀態(tài)精確地呈現(xiàn)出來(lái)，同時(shí)還體現(xiàn)出了動(dòng)態(tài)性和整體性的特點(diǎn)，其和中醫(yī)整體觀以及辨證觀相吻合[4]。本課題擬運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的代謝物，并與病情、腎組織病理、細(xì)胞因子等指標(biāo)的變化規(guī)律相應(yīng)對(duì)，找出與中醫(yī)血尿“濕熱證”相關(guān)聯(lián)的微觀指征，為下一步把握本病的干預(yù)時(shí)間點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 初篩76只健康雄性SD大鼠，3周齡，體質(zhì)量(90±20)g，購(gòu)自湖北省預(yù)防科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。喂養(yǎng)大鼠的飼料來(lái)自于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料加工廠。在提供無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心場(chǎng)地的湖北中醫(yī)藥大學(xué)飼養(yǎng)。屏障環(huán)境條件設(shè)置：光照周期為晝夜12 h交替，室溫控制在23～25 ℃，濕度45%～65%，造模期間，需要在人工氣候箱中對(duì)溫度和濕度進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)倫理委員會(huì)審批。

1.1.2 試劑與儀器 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(西格瑪奧德里奇公司，美國(guó)，批號(hào)：20160730)；脂多糖(西格瑪奧德里奇公司，美國(guó)，批號(hào)：20160830)；四氯化碳(CCl4)(武漢同興生物科技有限公司，批號(hào)：10654251)；二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：10023418)；大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)：20161015)；大鼠核因子κB酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：20161101)。固體核磁共振譜儀(布魯克公司，德國(guó)，型號(hào)：Bruker AVANCE III 600 MHz)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 76只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，未發(fā)現(xiàn)尿潛血和蛋白。篩除4只，將剩下72只按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和模型組，每組36只，造模方法為結(jié)合課題組前期研究[5-8]和張靜等[9]報(bào)道的方法。對(duì)照組：普通飲食喂養(yǎng)12周，隔日注入2 mL的酸化水，第6周、第8周用生理鹽水注入尾靜脈及皮下。模型組：連續(xù)喂養(yǎng)高脂及高糖飼料，隔日將0.1%的BSA酸化水(400 mg/kg)給大鼠灌胃，每周注入0.1 mL CCl4和0.3 mL花生油，皮下注射12周。從第4周開(kāi)始添加人工高溫濕熱環(huán)境。把大鼠置于恒溫恒濕箱中5 d，起始溫度設(shè)置為28～35 ℃，濕度70%～95%，溫度升高1 ℃/d，濕度增加5%/d。5 d后，大鼠回到屏障環(huán)境。第6周需要進(jìn)行尾靜脈注射，注射1%BSA酸化水(20 mg/kg)，1次/d，共3 d。第6周、第8周分別進(jìn)行尾靜脈注射脂多糖(0.05 mg/只)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)至第12周末。實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)：大鼠外觀濕熱證候，尿常規(guī)檢出血尿和(或)蛋白尿，腎組織病理改變與系膜增生性腎炎表現(xiàn)十分相似，利用免疫熒光可觀察到IgA沉積，此時(shí)可判斷造模成功[5-9]。

1.2.2 外觀觀察與指標(biāo)檢測(cè) 觀察大鼠的一般情況、每周稱(chēng)重并采集尿樣，用于尿紅細(xì)胞(Urine Red Blood Cell，URBC)、24 h尿蛋白定量(24 h UPro)檢測(cè)。第4、6、8、10周每組隨機(jī)選取6只大鼠，采集其尿液，12 h內(nèi)不得進(jìn)食，再稱(chēng)重，麻醉方法采用腹腔注射10%氫氯醛，心臟采血，血樣用于檢測(cè)生化指標(biāo)總膽固醇、尿素氮以及用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)和核因子κB(Nuclear Factor-Kappa B,NF-κB)。

1.2.3 腎組織超微病理檢測(cè) 取雙側(cè)腎臟組織，冠狀面切取0.2 mm厚的腎組織于10%甲醛固定做光鏡檢查(PAS染色，×400)；切下一小部分外周腎皮質(zhì)并冷凍，為免疫熒光IgA檢測(cè)提供樣本。

1.2.4 代謝組學(xué)分析

1.2.4.1 代謝尿采集方法 每周留取大鼠即時(shí)尿液(500 μL～1 mL)，無(wú)菌巾鋪于代謝籠下方，用無(wú)菌吸管取即時(shí)尿，裝入2.5 mL EP管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2.4.2 核磁共振氫譜(1H-Nuclear Magnetic Resonance，1H NMR)檢測(cè)方法 先對(duì)一維(1D)1H NMR譜進(jìn)行采集，頻率600.13 MHz，溫度25 ℃。取500 μL尿樣加入管a，振蕩搖勻，靜置10 min，離心分離時(shí)長(zhǎng)10 min，離心半徑97 mm，12 000 r/min，采集上清液450 μL，將這部分液體放入管b中，振蕩搖勻，靜置1 min。取45 μL Buffer加入管b中，振蕩搖勻，離心，取480 μL上清移至5 mm核磁管。借助于NOESYGPPR1D序列采集譜圖。參數(shù)設(shè)置：譜寬：20 ppm，等待時(shí)間：2 s，混合時(shí)間：100 ms，時(shí)間1∶4 μs，90°脈寬：15.2 μs，采樣時(shí)間：1.36 s，采樣點(diǎn)數(shù)：32 K，累加自由感應(yīng)衰減Free-induction Decay，F(xiàn)ID)次數(shù)：64次。

1.2.4.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將1H NMR的FID信號(hào)導(dǎo)入到Chenomx核磁軟件包(V8.1，加拿大)。自動(dòng)進(jìn)行傅里葉變換，調(diào)整相位，校正基線。每一個(gè)積分值面積都要進(jìn)行處理，采用歸一化方法，得到每一段的矩陣以及對(duì)應(yīng)的積分面積。利用主成分分析法以及正交偏最小二乘法，對(duì)不同化學(xué)位移點(diǎn)的差異峰進(jìn)行識(shí)別，得到差異化學(xué)位移點(diǎn)積分段的相對(duì)定量結(jié)果。

多元變量統(tǒng)計(jì)分析，主成分分析(PCA)為無(wú)監(jiān)督識(shí)別方法，可以觀察各組樣本的代謝輪廓。得分圖(Score plot)模型組(粉紅)與對(duì)照組(淡藍(lán))分開(kāi)。PCA載荷圖(Loading plot)反映了代謝物對(duì)主成分(PC1，PC2…)的貢獻(xiàn)率。正交偏最小二乘分析方法是一種有效的監(jiān)督識(shí)別方法。為區(qū)分樣本提供了支持。交叉驗(yàn)證(CV)在評(píng)估模型的質(zhì)量上發(fā)揮了作用，模型的質(zhì)量(R2)和模型的預(yù)測(cè)能力(Q2)可以作為模型質(zhì)量的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，排列組合驗(yàn)證(Permutation Test)在OPLS-DA模型分類(lèi)效果的評(píng)估上發(fā)揮了作用。然后開(kāi)始1 000次隨機(jī)排列組合實(shí)驗(yàn)

血尿濕熱證模型相關(guān)生物標(biāo)志物，VIP值可以反映出主要的變量，同時(shí)也可以反映出這些變量的重要程度。VIP值越高意味著在樣本區(qū)分中付出得越多。在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將VIP值大于1的代謝物進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05的代謝物被確認(rèn)為存在潛在可能的生物標(biāo)志物。

1.2.4.4 富集分析與代謝網(wǎng)絡(luò)圖 把潛在差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst5.0數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行代謝通路的富集分析，再利用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.kegg.jp)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 一般情況與生化指標(biāo) 對(duì)照組大鼠精神可、活動(dòng)自如、食欲可、二便調(diào)；模型組大鼠第4周后出現(xiàn)易疲倦，嗜睡、反應(yīng)遲緩、毛發(fā)濕潤(rùn)、食欲不振、小便短赤、大便軟爛、消瘦，部分大鼠可見(jiàn)皮下水腫、甚則陰阜潮濕等濕熱癥狀(死亡1只)。與對(duì)照組比較，模型組第5周起體質(zhì)量增長(zhǎng)速度放緩，第7周起體質(zhì)量增長(zhǎng)遲緩(P<0.05)，第11周最為明顯(P<0.01)；第6周出現(xiàn)血尿(P<0.05)，第8周可見(jiàn)蛋白尿(P<0.05)，且持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.01)；血肌酐、三酰甘油和總膽固醇增高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 2組大鼠體質(zhì)量、生化指標(biāo)的比較

2.2 腎臟超微病理及免疫熒光 對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)清晰完整，同時(shí)，腎小球處于正常狀態(tài)，毛細(xì)血管袢開(kāi)放情況良好，系膜細(xì)胞并未出現(xiàn)增殖，細(xì)胞外基質(zhì)也未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，腎小管結(jié)構(gòu)保持完整，間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組在第6周的時(shí)候，系膜細(xì)胞以及系膜基質(zhì)增生開(kāi)始出現(xiàn)。隨著實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，到第8周、第10周以及第12周增生愈發(fā)明顯。同時(shí)可以觀測(cè)到一些腎小球系膜區(qū)開(kāi)始呈現(xiàn)出分葉狀，并且擴(kuò)展速度越來(lái)越快。可以觀察到毛細(xì)血管的管腔變化，其變得越來(lái)越狹窄，同時(shí)腎小球的上皮細(xì)胞也與以往出現(xiàn)了不同的變化，開(kāi)始不斷腫脹、變性。在腎間質(zhì)中能夠觀察到一些炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，在系膜區(qū)出現(xiàn)了IgA免疫熒光沉積++。見(jiàn)圖2～3。

圖2 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎組織比較(PAS染色，×400)

圖3 第12周2組腎組織病理學(xué)比較(免疫熒光染色，×400)

2.3 細(xì)胞因子 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MNF-κB第6周升高(P<0.05)，早于TGF-β1第10周升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 2組大鼠NF-κB、TGF-β1比較

2.4 代謝輪廓 共找到61種代謝產(chǎn)物。見(jiàn)圖5。

圖5 代謝物歸屬譜圖(0～10.0×10-6)

2.5 多元變量統(tǒng)計(jì)分析 2組樣本在Score Plot圖中有分離的傾向。S-Plot圖顯示對(duì)應(yīng)于3.02、2.98等化學(xué)位移的代謝物。本模型R2=0.851 0,Q2=0.562 2，說(shuō)明模型質(zhì)量好且預(yù)測(cè)能力強(qiáng)(R2>0.5，Q2>0.5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示R2與Q2的P均小于0.01，無(wú)過(guò)擬合，意味著這一模型的分類(lèi)效果符合預(yù)期。見(jiàn)圖6。

圖6 PCA、OPLS-DA得分圖、載荷圖和S-Plot圖、交叉驗(yàn)證、排列組合驗(yàn)證(Permutation Test)

2.6 血尿濕熱證模型相關(guān)生物標(biāo)志物 共篩選出14種差異代謝物。見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，模型組總體趨勢(shì)表達(dá)下調(diào)的物質(zhì)共計(jì)10種；總體趨勢(shì)表達(dá)上調(diào)的物質(zhì)共計(jì)4種。見(jiàn)圖7。

圖7 VIP值

表1 IgA腎病幼齡大鼠血尿濕熱證模型相關(guān)生物標(biāo)志物

2.7 代謝通路分析 涉及19條通路。見(jiàn)表2。將Impact值>0.1的路徑視為潛在的靶標(biāo)代謝通路，結(jié)合代謝通路拓?fù)浞治鰵馀菘梢?jiàn)三羧酸循環(huán)、乙醛和二元酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等6條為主要代謝路徑。見(jiàn)圖8。在KEGG網(wǎng)站下載相關(guān)代謝途徑圖，描繪相關(guān)代謝途徑中差異代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)及14種潛在生物標(biāo)志物隨時(shí)間變化的折線圖。見(jiàn)圖9～10。

表2 通路分析結(jié)果

圖8 代謝通路拓?fù)浞治?/p>

圖9 相關(guān)代謝途徑中差異代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)

圖10 14種潛在生物標(biāo)志物時(shí)間變化趨勢(shì)

2.7.1 三羧酸循環(huán)代謝擾動(dòng) 檸檬酸、順烏頭、α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)主要參與物質(zhì)，表現(xiàn)為總體濃度呈下降趨勢(shì)，以脫離外濕環(huán)境的第5周更明顯(P<0.05或P<0.01)。說(shuō)明大鼠體內(nèi)三羧酸循環(huán)的能量代謝發(fā)生擾動(dòng)，這3種物質(zhì)的合成受到影響，與前述外觀改變一致。

生化層面可見(jiàn)第10周起模型組血肌酐顯著升高(P<0.05)，而相對(duì)應(yīng)在代謝層面可見(jiàn)尿肌酐第5周起含量降低，該趨勢(shì)持續(xù)至第10、11周時(shí)模型組較對(duì)照組出現(xiàn)明顯降低(P<0.05；P<0.01)。故肌酐改變可反映早期腎功能損傷情況。

2.7.2 腸道微生物紊亂 實(shí)驗(yàn)中模型組馬尿酸總體為下降趨勢(shì)，以5、7、12周最為明顯(P<0.05)。且甘氨酸水平降低，表明大鼠濕熱證造模使在肝內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程受到擾動(dòng)，與生化層面三酰甘油和總膽固醇增高共同提示了肝內(nèi)代謝異常。本實(shí)驗(yàn)中，氧化三甲胺和二甲胺在第5周表達(dá)上升，然后回調(diào)，之后又開(kāi)始緩慢上升。本實(shí)驗(yàn)第5周起苯乙酰甘氨酸增高(P<0.01)后總體呈下降趨勢(shì)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。4-羥基苯乙酸通過(guò)苯丙氨酸代謝路徑生成，再經(jīng)酪氨酸代謝可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，從第5周起即增高(P<0.01)，升高趨勢(shì)持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.7.3 氨基酸代謝擾動(dòng) 二者模型組與對(duì)照組比較發(fā)生擾動(dòng)(P<0.05或P<0.01)，去除造模因素影響后又回調(diào)，總體趨勢(shì)以下行為主，說(shuō)明體內(nèi)氨基酸代謝發(fā)生紊亂。

2.7.4 糖類(lèi)代謝擾動(dòng) 實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)模型組大鼠第5周蔗糖和葡萄糖醛酸明顯增高(P<0.01)，之后下降，到第9、10周再次小幅增高，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)較對(duì)照組下降。而葡萄糖在第6周開(kāi)始升高(P<0.01)，第8、10、12周明顯升高(P<0.01)，最終較對(duì)照組增高。

3 討論

我科國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)倪珠英教授指出兒童血尿病機(jī)表現(xiàn)為“以熱為先，因濕為重”，其發(fā)生與濕熱之間存在著必然聯(lián)系，并且濕熱也是影響其轉(zhuǎn)歸病理一個(gè)重要因素[10]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始即加入高糖高脂飲食，第4周加入高溫高濕環(huán)境，第6、8周給大鼠尾靜脈注射脂多糖和CCl4，該造模方法對(duì)大鼠“制造”了體內(nèi)、外濕熱環(huán)境，使其體內(nèi)胃腸受損，體外濕熱叢生。結(jié)合大鼠外觀濕熱證表現(xiàn)，尿檢中發(fā)現(xiàn)了血尿、蛋白尿，高脂血癥、腎功能下降，出現(xiàn)炎癥介質(zhì)啟動(dòng)、腎臟病理改變、IgA免疫熒光沉積等變化，表明該造模方法成功地建立了病證結(jié)合的IgA腎病幼齡大鼠血尿濕熱證模型。

在細(xì)胞因子層面，核因子κB參與多種炎癥介質(zhì)、趨化因子和促纖維化因子的合成、細(xì)胞凋亡等過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化先于其他炎癥介質(zhì)的激活和釋放[11]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)直接影響著介導(dǎo)腎小球疾病進(jìn)展。TGF-β1直接影響介導(dǎo)腎小球疾病進(jìn)展。TGF-β1過(guò)度表達(dá)時(shí)可以對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生一定影響[12]。說(shuō)明在造模早期即有炎癥因子啟動(dòng)及表達(dá)，與腎臟病理改變相對(duì)應(yīng)。

在代謝組層面，共篩選出14種差異代謝物[13]。IgA腎病大鼠的腸道菌群代謝、能量代謝、氨基酸代謝、糖代謝均出現(xiàn)了隨時(shí)間變化的代謝擾動(dòng)，IgA腎病的發(fā)病可能與這些代謝途徑的變化相關(guān)。能量代謝方面，三羧酸循環(huán)是能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)變樞紐[14]。α-酮戊二酸通過(guò)精氨酸生物合成精氨酸后再生成胍乙酸，后者與甘氨酸在脒基轉(zhuǎn)移酶作用下合成肌酸，加快肌酐的生成速度。借助于腎小球可將肌酐排出，如果觀察到腎小球病變，表示其濾過(guò)功能減退，排泄速率必然小于生成速率[15]。氨基酸代謝方面，腐胺和甘氨酸屬于氨基酸。腐胺主要是由鳥(niǎo)氨酸脫羧形成的[16]。甘氨酸為必需氨基酸非極性脂肪族，臨床上可降低血脂，促進(jìn)脂肪代謝。糖代謝方面，經(jīng)戊糖、葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化途徑，谷氨酸可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟侨┧幔笳呓?jīng)淀粉和蔗糖代謝路徑，轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜍斩姿崞咸烟牵俎D(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟恰；蚰蜍斩姿崞咸烟窃诎肴樘谴x下，轉(zhuǎn)變成尿苷二磷酸半乳糖，之后再進(jìn)行轉(zhuǎn)變，成為了蔗糖以及葡萄糖，后者再進(jìn)行分解，得到丙酮酸，受到線粒體氧化脫羧影響，形成了乙酰CoA，而后開(kāi)始進(jìn)入三羧酸循環(huán)[14]。糖是機(jī)體重要能量來(lái)源之一，本實(shí)驗(yàn)大鼠一直給予高糖高脂飲食，葡萄糖醛酸、蔗糖下降，可見(jiàn)糖相關(guān)代謝出現(xiàn)擾動(dòng)，而葡萄糖的含量增加也說(shuō)明糖轉(zhuǎn)化為能量進(jìn)入三羧酸循環(huán)的利用率降低。此外，其中涉及腸道微生物代謝途徑的5種代謝物質(zhì)，其豐度變化表明脂多糖、BSA可能引起大鼠腸道微生態(tài)擾動(dòng)，致腸道菌群功能失常，而使大鼠濕熱證狀態(tài)持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。腸道菌群分解含苯基化合物產(chǎn)生苯甲酸后，再在肝臟線粒體基質(zhì)與甘氨酸生成馬尿酸[17]。馬尿酸主要由腎臟以尿液的形式排出，一部分會(huì)經(jīng)過(guò)腎小管排泄，另一部分則會(huì)經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)，其水平異常可以體現(xiàn)出腎小球和腎小管的功能障礙[18]。本實(shí)驗(yàn)中馬尿酸水平降低說(shuō)明腎臟功能受累。腸道菌群將食物中的膽堿和L-肉堿分解產(chǎn)生甲基胺類(lèi)代謝物三甲胺，在肝臟經(jīng)過(guò)黃素單加氧酶，代謝成氧化三甲胺，再轉(zhuǎn)化為二甲胺隨腎臟排出體外[19]。正常情況下，二者可經(jīng)尿液排出體外。有研究表明血清氧化三甲胺濃度隨著腎功能的降低而顯著增加，正常成人尿液氧化三甲胺與血漿氧化三甲胺之間表現(xiàn)顯著正相關(guān)[20-21]。之后有學(xué)者進(jìn)行了一項(xiàng)成人隊(duì)列研究，該研究結(jié)果顯示尿液氧化三甲胺與肌酐比值在早期慢性腎臟病患者和健康對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.20)[22]。早期慢性腎臟病兒童G2-G3期尿液中DMA和氧化三甲胺的水平低于G1期兒童[23]。在腸道中，苯丙氨酸由厭氧菌先代謝成苯乙酸，后者在肝臟中結(jié)再與甘氨酸結(jié)合生成苯乙酰甘氨酸[24]。有研究發(fā)現(xiàn)小兒特發(fā)性腎病綜合征患兒存在尿4-羥基苯乙酸水平上調(diào)[25]。給結(jié)腸癌模型大鼠喂食含有強(qiáng)抗氧化劑白藜蘆醇食物時(shí)，大鼠尿液4-羥基苯乙酸水平下降，這表明了4-羥基苯乙酸水平與氧化應(yīng)激之間的相關(guān)性，而氧化應(yīng)激可能是腎功能神經(jīng)調(diào)節(jié)失衡和以足細(xì)胞異常及腎小球結(jié)構(gòu)改變或丟失為特征的組織損傷的致病因素之一[26]。有研究認(rèn)為，腸道微生物群在產(chǎn)生高水平IgA的小鼠和過(guò)度表達(dá)B細(xì)胞活性因子的轉(zhuǎn)基因小鼠中，其可以對(duì)IgA腎病的發(fā)病起到重要支持作用[27]。

本實(shí)驗(yàn)以時(shí)間為縱軸，從一般情況、生化、腎組織病理、細(xì)胞因子、代謝組學(xué)等多個(gè)維度進(jìn)行橫向?qū)Ρ取３醪桨l(fā)現(xiàn)模型大鼠代謝通路相應(yīng)代謝物的異常表達(dá)時(shí)間進(jìn)程與趨勢(shì)，從第5周起即有代謝組學(xué)層面的改變，均早于其他各維度異常改變的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，且各層面的內(nèi)涵并非畛域分明，而是緊密關(guān)聯(lián)，相互交集。為下一步明確血尿濕熱證幼齡大鼠的干預(yù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，將代謝組學(xué)用于預(yù)測(cè)血尿濕熱證模型的病變程度及治療節(jié)點(diǎn)，尚需更多實(shí)驗(yàn)研究的論證。