基于網絡藥理學探討黃芪治療缺血性中風的作用機制

唐秀松 陳 靜 張青槐 龐宇舟，2

(1 廣西中醫藥大學壯瑤藥工程技術研究中心，南寧，530200； 2 中央民族大學民族醫藥教育部重點實驗室，北京，100081)

缺血性中風(Ischemic Stroke，IS)是一種因腦血管閉塞或狹窄,導致局部腦組織缺血缺氧，引起腦組織軟化甚至壞死的神經系統疾病[1]。臨床表現為偏身麻木、半身不遂、口舌歪斜、吞咽困難等[2]。IS在臨床上是常見病、多發病,有“三高”的特點，即發病率高、致殘率高、復發率高,嚴重影響患者的生命質量，給患者和社會帶來了極大的經濟負擔[3]。現代醫學治療IS主要以溶栓、抗凝、抗血小板、調脂穩斑、控制血糖和血壓為主[4]。研究表明，中醫藥治療IS有一定的優勢。

國醫大師劉祖貽治療IS使用黃芪的次數較其他單藥多，常用藥量為30～60 g，并且丹參-黃芪、黃芪-山楂、葛根-黃芪是高頻藥對[5]。應用數據挖掘技術，發現王新志治療IS的883首復方中，黃芪出現311次[6]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalusmemeranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao]的根，其性微溫，味甘，歸脾、肺經。具有補氣固表、托毒排膿生肌、利尿作用。臨床常用于治療氣虛、脫肛、子宮脫垂、汗證、水腫等病癥[7]。現代藥理研究表明，黃芪含有皂苷類、氨基酸類、黃酮類、生物堿類、等化合物等，具有抗衰老、抗疲勞、抗心力衰竭、抗癌、提高免疫力等作用[8]。

網絡藥理學是通過借助計算機語言和數據庫數據挖掘來構建藥物與疾病之間相互作用的網絡關系，以進一步闡明藥物治療疾病機制的一門科學。該學科為研究中藥治療疾病的動物實驗研究提供了理論依據，為中藥現代化研究拓展了方向[9-10]。本研究擬通過網絡藥理學探討黃芪治療IS的作用機制。

1 資料與方法

1.1 黃芪有效成分及相關靶點的收集 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)以“黃芪”為關鍵詞進行搜索。其藥物有效成分是按照口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18進行過濾篩選，藥物相關靶點則不篩選，保存黃芪所有的相關靶點。

1.2 黃芪相關靶點的基因注釋 UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫又稱蛋白質數據庫，除蛋白質序列數據外，其中還包含了大量的注釋信息。Perl作為一種功能豐富的計算機程序語言，能快速將黃芪的相關靶點在UniProt數據庫進行蛋白匹配后獲得該蛋白對應的基因，即黃芪的靶點基因。

1.3 IS疾病基因的收集 以“Cerebral Ischemic Stroke”作為關鍵詞，檢索人類基因的綜合數據庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)中IS相關疾病，整理后去除重復的疾病基因，最終得到IS的疾病基因。

1.4 繪制韋恩圖 運用R軟件(https://www.r-project.org/)中的VennDiagram程序包對1.2獲得的黃芪藥物基因和1.3獲得的IS疾病基因進行分析處理，最終得到藥物與疾病二者的共同基因，即交集基因。

1.5 藥物-疾病相互作用網絡構建 對1.2獲得的黃芪相關基因和1.4獲得的黃芪-IS疾病交集基因利用Perl語言進行一一映射，獲得相應的網絡關系文本文件后運用Cytoscape軟件進行網絡關系圖可視化構建，最終得到中藥-有效成分-疾病-基因調控網絡。

1.6 藥物-疾病蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡構建 利用String數據庫(https://string-db.org/)導入藥物-疾病交集基因，檢測條件為種屬選擇Homo Sapiens，保存PPI網絡圖。下載并保存PPI網絡中的string_interactions.tsv文件。然后運用R軟件中的count.R對string_interactions.tsv文件進行分析處理，最終獲得PPI網絡核心基因的條形圖。

1.7 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將1.4所得的中藥-疾病交集基因利用計算機R軟件中的RSQLite程序包、BiocManager程序包、org.Hs.eg.db程序包進行處理，獲得交集基因的ID，獲得的基因ID后再次運用R軟件中的Colorspace程序包、Stringi程序包、DOSE程序包、ClusterProfiler程序包、Pathview程序包進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 黃芪藥物有效成分篩選和靶點收集結果 在TCMSP數據庫中獲得黃芪藥物有效成分20個，主要包括丁子香萜、熊竹素、常春藤苷皂元、β-谷甾醇、異鼠李素、美迪紫檀素、5′-羥基異氟尿嘧啶-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、7-O-甲基異丁香酚、9,10-二甲氧基翼果聚糖-3-O-尾-D-葡萄糖苷、(6aR，11aR)-9,10-二甲氧基-6a，11a-二氫-6H-苯并呋喃[3,2-c]鉻-3-醇、聯苯雙酯、芒柄花黃素、異黃烷酮、毛蕊同黃酮、山柰酚、富馬酸、(3R)-3-(2-羥基-3，4-二甲氧基化合物)苯并二氫吡喃-7-ol、異核糖醛-7,2′-二-O-葡萄糖苷、槲皮素等。黃芪相關靶點953個。

2.2 韋恩圖繪制結果 通過R軟件將180個黃芪藥物基因與2 606個IS疾病基因進行計算分析后，提取藥物-疾病的共同基因即交集基因，并準確繪制出韋恩圖，結果得到137個藥物-疾病共同基因。見圖1。

圖1 藥物-疾病韋恩圖

2.3 中藥-有效成分-疾病-基因網絡構建結果 運用Cytoscape軟件進行藥物-疾病網絡構建,拓撲分析結果顯示黃芪主要通過16個有效成分作用于137個靶點基因，這137個靶點基因可能影響IS的發生。見圖2。

圖2 中藥-有效成分-疾病-基因網絡

2.4 PPI網絡構建結果 在String數據庫中導入藥物-疾病的交集基因，結果顯示藥物與疾病之間相互作用蛋白包括AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8、PTGS2、CXCL8、EGF、MAPK1、EGFR、MMP9、MYC、FOS、IL1B、ESR1、CCND1、CCL2、MMP2、IL10、RELA、ICAM1、NOS3、PPARG、MAPK14、ERBB2、IL4、HMOX1、SERPINE1、AR等。其中AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN最有可能成為核心蛋白。見圖3～4。

2.5 GO富集分析結果 共得到144條GO生物學過程，主要涉及核受體活性、轉錄因子活性，直接配體調節的序列特異性DNA、細胞因子受體結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、類固醇激素受體磷酸酶結合等。見表1，圖5。

圖3 藥物-疾病PPI網絡

圖4 藥物-疾病核心蛋白條形圖

表1 GO生物學過程(Count≥5)

續表1 GO生物學過程(Count≥5)

圖5 GO生物學過程條形圖

2.6 KEGG通路富集分析 通過R軟件計算分析后，共得164條KEGG信號通路，主要包括了AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、IL-17信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、乙型肝炎病毒通路、前列腺癌通路、TNF信號通路、人巨細胞病毒感染通路、膀胱癌通路、胰腺癌通路、丙型肝炎通路、內分泌抵抗通路等。其中，按照校正P值，排名前三的是AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路與IL-17信號通路。見圖6。

圖6A KEGG條形圖

圖6B AGE-RAGE信號通路

圖6C 流體剪切應力與動脈粥樣硬化

圖6D IL-17信號通路

3 討論

IS屬于中醫“中風”的范疇，其基本病機是陰陽失調，氣血逆亂。病位在腦，與心、肝、脾、腎密切相關。肝腎陰虛、氣衰血少為本，肝陽上亢、風火相煽，瘀血阻滯和痰濕壅滯為標。臨床上根據患者的神志是否清醒，將中風分為中經絡和中臟腑。其中，補陽還五湯是治療中經絡-氣虛血瘀證的經典方，以黃芪四兩為該方的主藥。

通過KEGG通路富集分析結果發現，富集P值最顯著的信號轉導通路是AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路與IL-17信號通路。AGE-RAGE信號通路是指晚期糖基化終末產物(Advanced Glycosylation End Products，AGEs)-糖基化終末產物受體(Receptor of AGEs，RAGE)信號通路，AGE-RAGE信號通路具有多種生物學功能，能夠激活核因子κB(NF-κB)、轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)的產生、激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶引起氧化應激活性氧等[11]。而據現有資料表明，在中風后活性氧數量顯著增加[12]。流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路與動脈血管的粥樣硬化的進展密切相關[13]。IL-17信號通路中，白細胞介素(Interleukin，IL-17)是一個重要的炎癥介質，由輔助性T細胞(Th17)及先天性免疫細胞等分泌，在多種炎癥反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用，IL-17受體(IL-17R)通過信號轉導復合體IL-17R-Act1-TRAF6激活下游核因子κB、JNK等信號通路[14]。研究表明，IL-17/NF-κB p65信號通路在老年急性腦出血發病及組織損傷中具有重要的作用，通過信號轉導刺激各種細胞因子的產生，調節老年急性腦出血后炎癥反應，緩解急性腦出血后腦組織損傷[15]。

通過中藥-有效成分-疾病-基因網絡構建，結果發現黃芪抗IS的有效成分有16個，包括山柰酚、槲皮素、異鼠李亭、丁子香萜、熊竹素、常春藤苷皂元、聯苯雙酯、芒柄花黃素、毛蕊同黃酮等。山柰酚是一種黃酮類化合物，有抗氧化、抗炎、抗癌等多種作用[16-19]。山柰酚可改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能癥狀，減少腦梗死的病理形態學和海馬CA1區神經元超微結構,下調Toll樣受體4、核因子κB p65、腫瘤壞死因子-α和IL-1β的水平，起到保護神經的作用[20]。山柰酚糖苷可減少核因子κB和STAT3信號表達，抑制缺血再灌注大鼠的神經炎癥反應，減小腦梗死面積和神經元、部分細胞(小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞)損傷[21]。槲皮素是黃酮類家族成員之一，具有清除氧自由基、控制血糖、抗動脈粥樣硬化、抑制氧化應激反應、減少炎癥介質基因表達等作用[22-25]。槲皮素可降低糖尿病合并腦缺血再灌注損傷大鼠的血糖，提高血漿超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力、降低丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平，改善神經功能評分[26]。槲皮素上調糖尿病腦梗死大鼠的組織型纖溶酶原激活物mRNA表達、減少纖溶酶原激活物抑制物-1 mRNA表達[27-28]。芒柄花黃素屬于異黃酮類化合物，有抗炎、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病等功效[29-31]。山柰酚與芒柄花黃素能顯著改善心肌細胞缺氧狀況，緩解心肌受損程度[32]。芒柄花黃素可提高SOD水平、減少MDA水平，改善大鼠腦缺血再灌注后神經功能缺損程度，并能抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠Sph K1/S1P信號通路表達[33-34]。

據PPI網絡構建結果可知，AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN很有可能成為黃芪抗IS核心基因。蛋白激酶B是一種磷脂酰肌醇-3-激酶下游重要信號分子、信號轉導通路中關鍵的絲氨酸(Ser473)/蘇氨酸(Thr308)蛋白激酶[35]，分為蛋白激酶B1、蛋白激酶B2和蛋白激酶B3 3個亞型，其中蛋白激酶B1在大腦分布較多，可加速細胞的增殖[36-37]。羥基紅花黃色素A與芍藥苷聯合用藥可上調腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死區磷酸化蛋白激酶B1的表達,能協同保護腦缺血再灌注大鼠的腦損傷[38]。IL6是一種具有多種生物學效應(機體防御、急相反應、免疫反應和造血反應等)的細胞因子，同時也是腦缺血時的一種主要的神經元死亡抑制因子[39]。缺血半暗帶中神經元損傷程度與IL-6表達水平正相關[40]。IL-6含量與腦梗死發病后2～3個月MRI測定的腦梗死體積明顯相關[41]。血管內皮生長因子A主要參與血管生成[42]。急性腦梗死患者血清中血管內皮生長因子表達水平的上升，與腦梗死疾病嚴重程度有關[43]。胱天蛋白酶-3是一種蛋白酶，在細胞凋亡中起著關鍵的作用。敗醬總黃酮可減少腦梗死面積，下調腦組織中IL-6、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、胱天蛋白酶-3水平，改善腦缺血再灌注損傷[44]。JUN是1號染色體基因等。抑制c-Jun氨基末端激酶激活能降低大鼠腦缺血再灌注損傷,可能和裂解-胱天蛋白酶-3等表達有關[45]。因此可知，AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN和IS的發生、發展及預后密切相關。

研究發現，癌癥代謝調節、病毒應答反應、免疫調節等參與了黃芪治療IS的信號轉導過程。其中AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路是主要信號通路之一。晚期糖基化終末產物受體(Receptor Advanced Glycation End-Products，RAGE)能與AGEs配體特異性結合,下游的核轉錄因子被激活，提高炎癥介質表達,加劇動脈粥樣硬化的形成與發展[46]。而動脈粥樣硬化正是健康人患IS的高風險因素之一。IL-17屬于白細胞介素家族成員之一,是一種前炎癥介質及炎癥反應調控因子，可誘導多種細胞分泌炎癥介質(IL-6、IL-8等),加大炎癥反應,加重腦神經細胞的炎癥損傷[47]。TNF-α是單核-巨噬細胞分泌的細胞因子，可介導炎癥反應的級聯激活[48]。TNF信號通路與IS的發病息息相關[49-50]。

綜上所述，黃芪是通過16種有效成分作用于137個IS靶點發揮治療作用，黃芪治療IS的核心基因的KEGG信號通路主要涉及AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、IL-17信號通路等164條生物信號轉導過程，表明了多個生物學過程的介導和參與是中藥發揮治療作用的關鍵。本研究為黃芪治療IS提供了理論依據。