1例Rh(D
--)表型的臨床及分子生物學研究

張 知，王長奇，葉水文，高宏軍，付國昌，王 康△

1.江西省贛州市立醫院檢驗科，江西贛州 341000;2.江西省臨川嘉德第三醫院檢驗科，江西撫州 344100；3.南昌大學第二附屬醫院中西結合科，江西南昌 330006；4.江蘇省諾貝爾獎得主蒂姆亨特研究院輸血醫學研究中心，江蘇無錫214400

近10年，Rh血型系統的研究取得了豐碩成果和較大進展，積累了大量分子生物學的研究資料，但是各種RHCE變異型形成的原因及其臨床意義，Rh抗體產生的機制及意義等未知的領域有待進一步研究[1]。

近來作者在老年人中發現1例D為陽性、CcEe不表達的DC-c-E-e-(或者D--)表型患者，案例較為罕見。通過基因檢測，證實為RHCE*Ce/RHCE*Ce基因型。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男，82歲，江西撫州人，由于反復咳嗽，加重1 d而入院。

1.2儀器與試劑 試劑：ABO/RhD血型定型檢測試劑卡(批號：202107003)、Rh血型分型檢測卡(批號：202106033)、抗人球蛋白(抗IgG)檢測卡(批號：202012022)均由江蘇力博醫藥生物技術股份有限公司提供；人類紅細胞RHCE血型基因分型試劑盒(熒光PCR法)(批號：20210401)、RHCE外顯子(科研)測序試劑盒(批號：20210401)均由江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司提供；血液基因組DNA提取試劑盒(杭州博日公司)等。儀器：LB-3000血型卡離心機、LB-C02-1試劑卡孵育器均由無錫源博生物科技有限公司提供；離心機(日本久保田公司)；熒光定量PCR儀(杭州博日公司)；ABI 3730型基因分析儀(美國AB公司)。

1.3方法

1.3.1血常規檢測 按《全國臨床檢驗操作規程》在醫院進行檢測。

1.3.2血清學試驗

1.3.2.1ABO血型正反定型及RhD定型實驗 按照ABO/RhD血型定型檢測試劑卡的說明書操作步驟，進行ABO血型正定型、反定型及RhD血型定型。

1.3.2.2Rh血型定型實驗 按照 Rh血型分型檢測卡的說明書操作步驟，進行Rh血型系統的C、c、D、E、e抗原的檢測。

1.3.2.3不規則抗體測定 按照抗人球蛋白(抗IgG)檢測卡的說明書操作步驟進行抗體測定。

1.3.3分子生物學實驗

1.3.3.1血液基因組DNA的提取 按照血液基因組DNA提取試劑盒的說明書操作步驟提取基因組DNA。

1.3.3.2RHCE基因熒光分型 按照人類紅細胞RHCE血型基因分型試劑盒(熒光PCR法)的說明書操作步驟進行基因分型。

1.3.3.3RHCE基因外顯子測序 按照RHCE外顯子(科研)測序試劑盒的說明書操作步驟進行基因測序。測序結果與GenBank中RHCE基因的標準序列進行比對分析。

2 結 果

2.1血常規檢測 白細胞總數14.22×109/L，嗜中性粒細胞比例78.21%，淋巴細胞比例14.81%，單核細胞比例6.28%，嗜堿性粒細胞比例0.08%，嗜酸性粒細胞比例0.62%。

2.2血清學鑒定結果 ABO/RhD 血型抗原檢測中發現，患者ABO血型為O型，RhD 血型檢查為 D 陽性；Rh 血型分型鑒定D為陽性，CcEe均不表達；不規則抗體測定，結果均為陰性。

2.3RHCE基因序列分析 經序列測定和參考序列比對分析發現，WK712和WK713位于 RHCE基因第1外顯子編碼區的48位堿基由G突變為C(c.48G>C)，為純合突變；第2外顯子編碼區150位堿基由C突變為T(c.150C>T)、178位堿基由C突變為A(c.178C>A)、201位堿基由A突變為G(c.201A>C)、203位堿基由A突變為G(c.203A>G)、307位堿基由C突變為T(c.307C>T)，所有突變點均為純合突變。確定患者的RHCE基因型為 RHCE*Ce/RHCE*Ce 。測序結果見圖1。

圖1 患者外顯子1、2測序結果圖

3 討 論

本例患者外表正常，出生時并無雙胞胎，無輸血史和干細胞移植史，由于反復咳嗽，加重1 d支氣管肺炎而入院，無貧血病史。在醫院檢查中，Rh血型分型為 D 陽性，CcEe不表達；患者不規則抗體測定結果為陰性；RHCE 基因熒光分型為 CCee。 根據 ZHAO 等[2]報道的體系擴增 RHCE 基因 10 個外顯子片段，測序分析，該標本 RHCE 基因型符合RHCE*Ce/RHCE*Ce。本例患者與其他報道[3-5]有差異，導致 RhCE 抗原不表達的原因有待進一步探討。

國內對 CcEe 表型的研究，RhD(+) 個體>90%是 CCee、CcEe 和 Ccee 表型，其中以 CCee 最多，占 51.82%[6]；本例患者表型是 CCee。Rh血型是一種較為復雜的血型系統，Rh抗原能引起嚴重的免疫反應和新生兒溶血病。2000年原衛生部發布的《臨床輸血技術規范》明確要求檢測RhD抗原，但未規定檢測CcEe抗原。然而，當供者與受者CcEe抗原表型不合進行輸血時常會導致相應同種抗體的產生。本例患者沒有輸血；如果病情需要進行臨床輸血，且不檢測CcEe 抗原進行配合輸注，很可能發生輸血反應，不利于患者康復。因此作者認為如果能針對特殊個例進行Rh 5項全面檢測，條件成熟時建立和完善我國 D--稀有血型庫，對發生意外需要臨床輸血的患者會很有助益。尤其是對于有長期輸血需求的患者，CcEe抗原全部相合最為安全。

本例D--與RHCE基因異常有關，也存在基因變異體并形成CcEe 抗原變異體，這些變異體可導致血清學抗原鑒定或基因分型出現一些假陽性或假陰性[7-8]。本例CcEe 抗原的變異體無表達，常規檢測方法難以準確定型，可能導致同種免疫的發生，這樣患者日后輸血會面臨更大風險。應用RHCE 基因分型配合血清學分型技術，研究 RHCE 基因的多態性以及造成抗原表型多樣性，對于提高血清學檢測及分子定型的準確性，減少臨床輸血反應意義較大。

本例D--表型，經過RHCE基因檢測發現RHCE基因突變并不是該表型產生的分子機制。從檢測結果看，熒光分型和測序結果都判定為樣本基因型為RHCE*Ce/RHCE*Ce，血型理論上是CCee，但血清學試驗是C-c-E-e-。此種現象相當罕見，需要尋找其他分子機制解釋，下一步擬對標本進行家系調查。它的發現對我們進一步研究人類遺傳性疾病發生的分子基礎提供了寶貴的素材。相信經過廣大醫學工作者的努力，這一領域的研究一定會取得突破性進展。