基于ceRNA網絡篩選卵巢癌鉑類藥物的耐藥基因及臨床驗證

馬文娟，蘇 琦

陜西省西北婦女兒童醫院藥劑科，陜西西安 710061

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，調查顯示卵巢癌發病率地域性明顯，卵巢癌早期檢出率低，超過40%患者被確診時已處于中晚期[1]。化療在卵巢癌中得到廣泛應用，已成為卵巢癌治療的重要方法，其中鉑類藥物被指南推薦為一線治療藥物[2]。但鉑類藥物的耐藥問題逐漸突出，影響化療效果和患者預后[3]。目前，臨床認為鉑類藥物耐藥是由多基因、多因素共同作用的結果，與DNA損傷、DNA分子通路密切相關[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)自cDNA測序被發現以來，其在卵巢癌細胞生長、轉移、侵襲及增殖中的作用被證實，還有研究顯示lncRNA可與RNA結合蛋白相互作用，參與卵巢癌耐藥[5]。近年來有學者提出競爭性RNA(ceRNA)概念，即具有相同miRNA應答元件的mRNA、lncRNA等轉錄物通過競爭性結合參與調控細胞功能，發揮生物學功能[6]。本研究采用細胞生物學方法建立ceRNA調控網絡，探討其在篩選卵巢癌鉑類藥物耐藥基因中的價值，并驗證其可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年4月至2020年4月在本院治療的64例卵巢癌鉑類藥物耐藥患者作為耐藥組，患者平均年齡(48.09±13.37)歲；按國際婦產科聯盟(FIGO)分期，Ⅲ期42例，Ⅳ期22例；腫瘤平均最大徑(4.36±1.02) cm。另納入同期在本院治療的64例對鉑類藥物敏感的卵巢癌患者作為對照組，患者平均年齡(47.71±12.85)歲；按FIGO分期，Ⅲ期37例，Ⅳ期27例；腫瘤平均最大徑(4.50±0.94)cm。兩組患者一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究獲本院倫理委員會審批同意。所有患者均知悉本研究內容，簽署知情同意書。

納入標準：(1)鉑類耐藥診斷參照FIGO和美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南標準[7]。耐藥，即接受規范化療達到臨床緩解目標，完成化療后復發時間<6個月；敏感，即接受規范化療達到臨床緩解目標，完成化療后6個月內無復發。(2)患者均接受手術+化療治療，并通過手術病理檢查確診為卵巢癌。(3)臨床資料完整。(4)患者年齡≥18歲。

排除標準：(1)妊娠或哺乳期患者；(2)精神意識障礙者；(3)肝腎功能嚴重不全或有嚴重心肺基礎疾病者；(4)合并有其他惡性腫瘤者。

1.2方法

1.2.1構建ceRNA調控網絡 利用PubMed數據庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)在線檢索與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關的lncRNA文獻，再分別利用RNA Locate與LncATLAS在線平臺分析定位lncRNA位置，以DIANA-lncBase和miRcode在線平臺分析記錄與lncRNA結合的miRNA，并采用miRTarBase在線工具分析miRNA靶向mRNA。以DAVID在線平臺進行基因本體(GO)功能注釋，并行京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。以綜合得分>10分、P<0.01為標準，記錄差異有統計學意義的基因。采用ceRNA預測數據庫在線平臺(http://www.bio-bigdata.net/miRSponge)構建ceRNA調控網絡。

1.2.2臨床檢驗驗證 取兩組患者手術病理標本1.0～3.0 cm，取新鮮組織標本切片至直徑2～5 mm，置于EP管，存于液氮罐中備用。根據ceRNA調控網絡構建的結果，采用熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測ceRNA網絡中關鍵lncRNA的水平，試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供，以GAPDH作為內參對照，以2-ΔΔCt計算基因水平。

1.2.3生存預后觀察 患者化療結束后進行隨訪，隨訪以電話和入院復診形式進行，每2周電話隨訪1次，以發生腫瘤進展為隨訪終點，記錄并比較不同HOTAIR和SOX2水平卵巢癌患者無進展生存(PFS)率。

2 結 果

2.1與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關的lncRNA 通過PubMed數據庫篩選與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關的lncRNA：上調12個，包括lncRNA ORM1、lncRNA ITPA、lncRNA HOTAIR、lncRNA DEPDC7、lncRNA IMPDH2、lncRNA AKAP12、lncRNA HULC、lncRNA SLIT3、lncRNA PDE4D、lncRNA NRF2、lncRNA SOX2及lncRNA BRCA2；下調5個，包括lncRNA GPX3、lncRNA CAIR、lncRNA HCP5、lncRNA PRKDC及lncRNA LAMP3。

2.2構建卵巢癌鉑類藥物耐藥相關ceRNA調控網絡 經亞細胞定位顯示，有6個lncRNA與鉑類藥物耐藥相關，且均存在于細胞質中，見表1。lncRNA-miRNA調控預測顯示，miR-148b-3p、miR-130a、miR-34a、miR-218-5p、miR-362-3p、miR-183-5p、miR-183、miR-145、miR-126、miR-1696、miR-921、miR-17、miR-185共13個miRNA與lncRNA分子存在靶向結合關系。根據GO和KEGG分析結果構建ceRNA調控網絡，結果顯示，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2是ceRNA網絡中兩個關鍵的lncRNA，其中lncRNA HOTAIR與miR-148b-3p、miR-130a、miR-519d及OCT4、HRAS、XIAP組成ceRNA網絡，lncRNA SOX2與miR-302、miR-429、miR-140-3p及EGFR、ABHD2、ALDH1構成ceRNA。故臨床驗證中主要檢測lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2兩個基因。

表1 定位于細胞質的6個lncRNA

2.3兩組患者lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2相對表達量的比較 耐藥組患者lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2水平分別為2.72±0.58和1.45±0.37，明顯高于對照組的1.92±0.49和1.26±0.40，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判斷卵巢癌鉑類藥物耐藥及患者預后的價值 ROC曲線分析顯示，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2對判斷鉑類耐藥具有一定的應用價值(AUC>0.75，P<0.05)。見圖1和表2。128例卵巢癌患者中lncRNA HOTAIR<2.350者59例，10例腫瘤進展，1年PFS率為83.1%；lncRNA HOTAIR≥2.350者69例，24例腫瘤進展，1年PFS率為65.2%。lncRNA SOX2<1.325者68例，13例腫瘤進展，1年PFS率為80.9%；lncRNA SOX2≥1.325者60例，21例腫瘤進展，1年PFS率為65.0%。lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者PFS率差異有統計學意義(Log-rankχ2=5.501、4.054，P=0.019、0.044)，見圖2、3。

圖1 lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判斷卵巢癌鉑類藥物耐藥的ROC曲線分析

表2 lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2判斷卵巢癌鉑類藥物耐藥的ROC曲線分析結果

圖2 不同lncRNA HOTAIR水平患者1年PFS率比較

圖3 不同lncRNA SOX2水平患者1年PFS率比較

3 討 論

目前有關卵巢癌鉑類藥物耐藥機制已深入分子領域，研究證明基因參與跨膜轉運、DNA損傷修復、信號通路傳導及腫瘤細胞增殖等多種生物學行為[8]。lncRNA屬非編碼RNA，可通過調控基因表達參與染色體修飾、蛋白質折疊及細胞信號通路調節等過程，lncRNA還可經其二級結構與蛋白質核酸結合，進而調控腫瘤細胞分裂、凋亡[9]，在腫瘤耐藥中發揮重要作用。而ceRNA包含miRNA和miRNA應答元件，可通過與lncRNA結合，調控基因表達[10]。ceRNA調控網絡由ceRNA-miRNA-mRNA構成，在該網絡中，各RNA分子間可競爭性結合miRNA，拮抗miRNA對編碼基因的抑制作用，從而達到相互調控、維持基因表達穩定的目的[11]。因而，通過ceRNA調控網絡有助于進一步深入探討腫瘤耐藥機制。

亞細胞定位、miRNA及MRE序列與ceRNA調控網絡效能密切相關。本研究通過RNALocate和lncATLAS在線平臺對與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關的lncRNA進行定位，并在此基礎上進行關聯分析，挖掘與鉑類耐藥相關的關鍵lncRNA，構建ceRNA調控網絡，進而通過臨床試驗進一步證實關鍵lncRNA與鉑類藥物耐藥及卵巢癌患者預后的關系，為今后靶向治療提供依據。本研究結果發現lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2是關鍵的ceRNA分子，在ceRNA調控網絡中發揮重要作用，lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2異常高表達將增加卵巢癌鉑類藥物耐藥風險，且降低PFS率。通過監測lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2水平，并指導臨床早期干預，將有助于避免耐藥及提高治療效果。

lncRNA HOTAIR是首個被發現的具有反式轉錄作用的lncRNA，具有特異性雙向結合功能，并與PRC2、LSD1等形成復合體，產生級聯效應[12]。lncRNA HOTAIR已被證實在卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，而沉默lncRNA HOTAIR能顯著抑制卵巢癌細胞侵襲、增殖[13]。本研究結果顯示lncRNA HOTAIR定位于卵巢癌細胞質和細胞核中，提示其可能在卵巢癌鉑類藥物耐藥中發揮關鍵作用。NADAL等[14]也發現lncRNA HOTAIR可能通過調節p21WAF1/CIP1，增強肺腺癌對鉑類藥物的耐藥性。FAYDA等[15]則證明lncRNA HOTAIR表達水平與p21 mRNA呈負相關。本研究顯示lncRNA HOTAIR可能通過抑制miR-519d，靶向作用于XIAP、OCT4。同時，lncRNA-miRNA-mRNA這一調控網絡能更清晰闡述lncRNA HOTAIR參與卵巢癌鉑類藥物耐藥的機制。本研究發現lncRNA HOTAIR作為ceRNA，可與mRNA競爭miRNA-148b-3p結合位點，影響mRNA表達，進而干擾其對靶基因的調控，參與耐藥。lncRNA SOX2屬于干細胞標志蛋白，韓玲等[16]的研究顯示lncRNA SOX2過表達可促進卵巢癌細胞遷移、增殖，基礎研究還證明lncRNA SOX2可調控MMP-9、FN1活性，促進腫瘤轉移，而敲除lncRNA SOX2則可增加腫瘤細胞凋亡，降低化療敏感性[17]。本研究顯示lncRNA SOX2可靶向作用于與耐藥相關的miR-302、miR-429及miR-140-3p，進而調控EGFR、ABHD2。因而，推測lncRNA SOX2可能通過調控EGFR和ABHD2參與卵巢癌鉑類藥物耐藥。

lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2在ceRNA網絡中發揮關鍵作用，為進一步證實上述結果，本研究收集對鉑類藥物耐藥與敏感的卵巢癌各64例，采用RT-PCR法檢測lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2在鉑類藥物耐藥與敏感癌組織中的表達量，對比分析二者對判斷耐藥的價值，并觀察lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者的預后。本研究結果顯示lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2判斷鉑類藥物耐藥的AUC分別為0.875和0.750，提示檢測癌組織lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2水平有助于鉑類耐藥的早期篩查，這對于指導臨床用藥具有較高應用價值。另外，lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2不同水平的卵巢癌患者1年PFS率差異顯著，這一結果說明lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2有助于判斷卵巢癌患者預后，逆轉lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2水平有助于改善PFS率，這將為今后臨床靶向治療提供新的方向。但癌組織lncRNA HOTAIR與lncRNA SOX2檢測可重復性差，是否可采用血清指標替代癌組織作為試驗標本用于耐藥和預后判斷，還有待于今后進一步研究證實。

綜上所述，ceRNA網絡有助于篩選卵巢癌鉑類藥物耐藥相關基因，lncRNA HOTAIR和lncRNA SOX2與卵巢癌鉑類藥物耐藥密切相關。