艾葉提取物對肺炎支原體感染小鼠模型血清IL-6、IL-10和TNF-α水平的影響*

徐 沙，李云芬，劉榮均，柴 琳

云南中醫藥大學第三附屬醫院檢驗科，云南昆明 650011

肺炎支原體(MP)肺炎是兒童社區獲得性肺炎的主要原因[1-2]，盡管迄今為止已經在動物和人類中發現了200多種支原體，但MP是其中最常見的感染人類的支原體，引發20%～40%的小兒肺炎，影響兒童的生長發育。MP感染主要病理表現為間質性肺炎和毛細支氣管炎[3]。目前臨床治療MP感染的首選藥物為大環內酯類抗生素，但其耐藥率逐漸上升，并有腸胃不適等不良反應發生，臨床療效差[4]。但使用抗生素后，MP感染發病率并未下降，因此如何有效地治療MP成為研究的重點[5]。細胞因子在MP感染中起著關鍵的作用[6-7]，如白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[8]，可以促進炎癥發生，使炎性反應擴大化。自古艾葉被民間廣泛用于消毒，因為其具有抗菌、抗病毒的功效。已有研究報道，艾葉提取物可以平喘止咳、散瘀驅寒，其中尤以平喘作用最為顯著[9]，而MP感染主要表現為呼吸系統疾病[10-11]，本研究團隊前期體外藥敏實驗研究結果表明艾葉水提物具有抑制MP生長的作用，然而其不同水平提取物對抗 MP 感染的差異尚不明確。據前期的研究結果顯示，體外抑菌實驗表明艾葉粗提藥液對2株MP菌株(ATCC29342、MP19流行株)有一定的抑制作用(尚未發表)，但MP感染小鼠后艾葉的作用主要集中于免疫調節，與體外抑菌實驗不同，因此本研究擬通過研究艾葉提取物對MP感染小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α的表達影響，以及對肺部組織病理變化的影響，為進一步研究艾葉相關活性成分及臨床應用奠定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)4周齡雌性BALB/c小鼠，體質量10～20 g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，飼養于溫度為25～26 ℃、相對濕度為45%～55%的環境中。本次研究中飼養及處理方法均遵守動物倫理原則。

1.2方法

1.2.1MP培養 MP菌株ATCC29342、MP19(均由昆明醫學生物學研究所贈送)，均由本實驗室培養、傳代和凍存，培養基均為Pleuropneumonia-Like Organisms(PPLO)培養基，均于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養10～15 d，傳代過程中采用顏色改變單位法(CCU)定量調整菌體濃度為1×109CCU/mL，-20 ℃冷凍保存備用。

1.2.2艾葉提取物制備 取艾葉(批號：2010003，購自云南和合中藥飲片有限公司)100 g，采用二次煮沸法進行中藥原液制備，所得藥液最終合并濃縮成100 mL(1 mL原液相當于中藥材1 g)，實驗前用滅菌水在無菌條件下進行倍比稀釋，稀釋終水平分別為250.0、125.0、62.5 mg/mL，配制好的藥液均存放于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3小鼠分組與建模 選取40只BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、艾葉提取物不同水平組(250.0、125.0、62.5 mg/mL)，每組8只。除對照組外，其余小鼠用乙醚進行麻醉，鼻腔內接種50 μL 1×1010CCU/L菌液，每天1次，共滴鼻5 d，建立MP感染模型。對照組小鼠滴入等量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，實驗過程重復3次。

1.2.4小鼠灌胃 MP感染小鼠5 d后，不同水平艾葉提取物組采用不同稀釋水平的艾葉混懸液對模型組小鼠灌胃，每次0.2 mL，每天1次，連續給藥7 d，期間稱量小鼠體質量，灌胃7 d后不禁食禁水。對照組與模型組小鼠用等量滅菌水灌胃，之后處死用75%乙醇消毒解剖，提取小鼠肺組織。分離小鼠左右兩側肺組織，稱取肺濕重，計算肺濕重指數(肺濕重指數=肺質量/體質量×100%)，-80 ℃儲存備用。

1.2.5蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理變化 取小鼠肺部組織，4%組織固定液固定48 h，洗滌，置于不同的乙醇濃度梯度中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm厚片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，封片，顯微鏡(Olympus，BX43)下觀察，采用組織評分系統進行病理評分。

1.2.6細胞因子微球檢測技術(CBA)檢測血清IL-6、IL-10和TNF-α水平 摘取小鼠眼球取血，靜置15 min，3 000×g離心5 min，取上清液，CBA法檢測血清IL-6、IL-10和TNF-α水平，后續用流式細胞儀BD Cnto2 的FCAP Array V3 軟件進行分析。IL-6、IL-10和TNF-α檢測試劑盒購于美國BD生物技術有限公司，檢測過程嚴格按照CBA試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1MP感染后小鼠體質量、肺濕重指數、病理評分變化 MP19感染后小鼠體質量[(13.85±0.01)g]顯著低于ATCC29342感染的小鼠[(19.36±0.01)g]和對照組小鼠[(19.47±0.05)g](P<0.05)，因此采用被MP19感染的小鼠進行后續試驗。MP19感染小鼠后，采用不同水平的艾葉提取物灌胃，結果發現：與對照組比較，模型組小鼠肺濕重指數和病理評分升高(P<0.05)。與模型組比較，250.0、125.0、62.5 mg/mL艾葉提取物組小鼠病理評分均降低(P<0.05)，肺濕重指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺濕重指數、病理評分情況

2.2各組小鼠肺組織病理變化 對MP感染后小鼠灌胃1周，提取的肺組織采用HE染色、高倍鏡(×40)下進行病理切片觀察。模型組與對照組比較，模型組肺部結構中支氣管周圍的肺間質和肺泡腔的肺間質可見輕度水腫，并可見大量淋巴細胞浸潤，支氣管周邊淋巴細胞浸潤更明顯，支氣管周圍肺泡間隔可見纖維增生，間隔增寬，見圖1。當對MP感染小鼠用不同水平的艾葉提取物灌胃后，相對于模型組，250.0 mg/mL艾葉提取物組的小鼠肺組織局灶肺泡間隔增寬伴淋巴細胞浸潤，全肺組織肺泡腔無滲出，偶見散在的淋巴細胞浸潤(圖1)；125.0 mg/mL艾葉提取物組的小鼠肺組織支氣管和血管周圍可見呈片狀、實性的淋巴細胞聚集，余肺泡腔可見散在淋巴細胞浸潤，無滲出液(圖1)；62.5 mg/mL艾葉提取物組的小鼠肺組織炎癥較250.0、125.0 mg/mL艾葉提取物組重(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE染色，×40)

2.3各組血清IL-6、TNF-α、IL-10水平比較 MP19感染小鼠后，與對照組比較，模型組中IL-6和TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較：不同水平艾葉提取物組的血清IL-6水平均降低(P<0.05)；250.0 mg/mL艾葉提取物組和125.0 mg/mL艾葉提取物組的血清IL-10水平均升高(P<0.05)，62.5 mg/mL艾葉提取物組血清IL-10水平無明顯變化(P>0.05)；250.0 mg/mL艾葉提取物組血清TNF-α水平降低(P<0.05)，125.0 mg/mL艾葉提取物組和62.5 mg/mL艾葉提取物組血清TNF-α水平均升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清IL-6、TNF-α、IL-10水平比較

3 討 論

MP是一種介于細菌與病毒之間的微生物[12]，為呼吸道疾病的重要病原體，尤其兒童容易感染且發病年齡較早，感染后肺外臟器會受嚴重損害，但MP感染具體的致病機制尚不清楚。而艾葉是有效的平喘、祛痰、鎮咳的藥物，已有研究發現艾葉的水提物對肺炎雙球菌等有治療作用，甚至對呼吸道病毒也有一定的治療作用[9]，且艾葉提取物對小鼠炎癥有一定的抗感染療效[9]，因此研究艾葉對MP感染的治療有重要意義。本研究初步發現MP感染后小鼠體質量下降，同時感染后小鼠肺濕重指數和肺組織病理評分升高，結果表明MP感染小鼠會對小鼠有相應的損傷。

已有研究報道MP感染小鼠后主要改變小鼠的肺部結構[8]，艾葉是否會減輕小鼠肺部組織炎癥？本研究觀察MP感染小鼠的肺部組織病理結構，結果初步顯示，小鼠受MP感染后，肺部組織病理結構發生不同程度的改變。為進一步探討不同水平艾葉提取物對小鼠肺部組織的影響，在用MP感染小鼠5 d后，用不同水平的艾葉提取物灌胃，結果表明感染后，肺部組織炎癥加重，經不同水平的艾葉提取物作用后，炎癥相對于模型組都有所減輕，提示艾葉提取物對MP感染小鼠有一定的治療作用，但本研究僅用了艾葉單味中藥，具體的治療機制需進一步探索。

有研究報道過度炎性反應在MP感染中發揮重要的作用[10]，MP感染小鼠后會表達多個炎癥因子參與炎性反應[11]，例如IL-6、IL-10和TNF-α，因此調節血清細胞炎癥因子水平有助于減少炎癥的發生，從而減輕免疫損傷[13]。IL-6作為重要的炎癥因子之一，與免疫炎性反應密切相關[14]，通過檢測IL-6水平可以有效判斷炎癥的損傷程度，因此IL-6也作為判斷感染的指標之一[15]。研究表明IL-6升高是判斷出現炎癥的指標[16]。本研究結果顯示，MP感染小鼠后血清IL-6水平上調，當對MP感染小鼠用62.5 mg/mL艾葉提取物灌胃后，血清IL-6水平下調，病情好轉。本研究結果顯示血清IL-6水平與機體的感染有關，與其他研究報道結果一致[8]。IL-10是一種抑制性的淋巴因子，主要機制為抑制炎性反應，從而調節免疫細胞的分化與增殖[17]。本研究結果顯示，在受MP感染后，小鼠血清IL-10水平下調，但對MP感染小鼠用62.5 mg/mL艾葉提取物灌胃治療后，血清IL-10水平上調，結果顯示這可能與機體的免疫調節相關。臨床研究證實，TNF-α能準確評價和確定炎癥的產生[18]。本研究結果顯示，在MP感染小鼠后，血清TNF-α水平急劇上升，在不同水平艾葉提取物作用后，250.0 mg/mL艾葉提取物組血清TNF-α水平下調，125.0、62.5 mg/mL艾葉提取物組血清TNF-α水平上調，表明不同水平的艾葉提取物對TNF-α的影響不同，但影響機制還需進一步研究。

綜上所述，本實驗通過建立MP感染小鼠模型，發現MP感染后小鼠肺部組織發生不同程度的改變，用不同水平的艾葉提取物灌胃小鼠后，小鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α水平發生不同變化，影響不一，這為進一步探討MP感染相關機制奠定了相應的理論基礎，同時也初步表明不同濃度的艾葉提取物會對MP感染小鼠血清IL-6、IL-10和TNF-α產生不同程度的影響，這為后期探討其相關機制和臨床研發精準用藥提供了相應的理論基礎。