全身正弦波交變電磁場(chǎng)對(duì)于高糖高脂飲食2型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響*

胡國(guó)花，蔡 婧，蘭 娜△

1.陜西省西安市西電集團(tuán)醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710077;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，陜西西安 710032

糖尿病是全世界發(fā)病率最高的慢性非傳染性疾病，目前全球約有4.5億糖尿病患者，而我國(guó)糖尿病患者高達(dá)1.2億[1]。我國(guó)是全球糖尿病第一大國(guó)，糖尿病已成為制約我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個(gè)重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題[2-3]。糖尿病主要分為1型糖尿病、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病和其他類型糖尿病4種，其中T2DM占糖尿病發(fā)病總?cè)藬?shù)的90%以上，是最主要的糖尿病類型。T2DM患者因長(zhǎng)期存在的高血糖狀態(tài)，會(huì)誘發(fā)機(jī)體包括心臟、神經(jīng)、眼、腎臟的慢性損傷[4]。神經(jīng)病理性疼痛是T2DM最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，有近50%的T2DM患者會(huì)發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛，臨床主要表現(xiàn)為自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏和異常性疼痛[5-6]。目前，臨床對(duì)于T2DM神經(jīng)病理性疼痛尚無(wú)有效的治療對(duì)策，而常用的鎮(zhèn)痛藥、抗焦慮藥、抗炎藥和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類藥物，不僅療效難以令人滿意，并且還存在著高藥物不良反應(yīng)和耐藥性的問(wèn)題[6-7]。交變電磁場(chǎng)治療是目前臨床常見(jiàn)的物理治療方法，其積極療效已在骨骼肌、皮膚及心血管相關(guān)疾病中得到了充分證實(shí)[8-9]。也有學(xué)者們發(fā)現(xiàn)交變電磁場(chǎng)具有明顯抑制疼痛的作用[10-11]。但是，交變電磁場(chǎng)治療對(duì)于糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(尤其是T2DM神經(jīng)病理性疼痛)的作用效果，目前鮮見(jiàn)被系統(tǒng)闡明。本研究通過(guò)鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂高糖飲食法構(gòu)建T2DM動(dòng)物模型，系統(tǒng)探討交變電磁場(chǎng)輻照療法對(duì)于T2DM神經(jīng)病理性疼痛的作用效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡雄性SD大鼠30只，SPF級(jí)，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2儀器與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；血糖分析儀購(gòu)于美國(guó)Lifescan公司；von Frey絲購(gòu)于美國(guó)Stoelting公司；熱痛敏刺激和測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)于意大利Commat公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京天根生物技術(shù)公司；Maxima SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；總RNA提取試劑Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于溫度為(23±1)℃、濕度為(55±5)%及每日光照12 h的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。使用STZ聯(lián)合高脂高糖飼喂法構(gòu)建T2DM動(dòng)物模型，具體步驟：SD大鼠使用高脂高糖飼料(包含10%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉)飼養(yǎng)4周，隨后行過(guò)夜禁食處理，次日清晨通過(guò)腹腔注射濃度STZ緩沖液(35 mg/kg)，繼續(xù)高脂高糖飲食飼養(yǎng)4周，使用血糖儀測(cè)量大鼠隨機(jī)血糖值，血糖>16.7 mmol/L并表現(xiàn)出多飲、多食、多尿的“三高”癥狀的大鼠被認(rèn)定符合T2DM標(biāo)準(zhǔn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)共分為3組，分別為空白對(duì)照組(對(duì)照組)、T2DM組及T2DM交變電磁場(chǎng)治療組(T2DM+EMF組)，每組10只。給予對(duì)照組大鼠常規(guī)(非高糖高脂)飲食；對(duì)T2DM+EMF組大鼠施加全身性的正弦交變電磁場(chǎng)暴露8周，每周1 h；對(duì)照組和T2DM組大鼠同樣放入電磁線圈中，但不施加電流，作假暴露處理。

1.3.2交變電磁場(chǎng)發(fā)生系統(tǒng) 交變電磁場(chǎng)發(fā)生系統(tǒng)主要包括電信號(hào)發(fā)生器和Helmholtz線圈兩部分。電信號(hào)發(fā)生器以MSP430單片機(jī)為核心，負(fù)責(zé)輸出正弦波交變?nèi)蹼娦盘?hào)，對(duì)產(chǎn)生的波形、頻率、強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行控制，并負(fù)責(zé)捕獲鍵盤(pán)的輸入信號(hào)，按用戶設(shè)定的命令進(jìn)行輸出，該弱電信號(hào)經(jīng)過(guò)信號(hào)調(diào)制、整流、濾波和放大處理后，將信號(hào)輸出至Helmholtz線圈。Helmholtz線圈包含2個(gè)直徑相同(線圈間距40 cm)且等軸放置的線圈組，線圈匝數(shù)為100，線圈間距20 cm。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于塑料籠中，動(dòng)物身體與線圈中軸線在同一水平面。實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的交變電磁場(chǎng)峰值強(qiáng)度為5 mT，頻率為50 Hz。

1.3.3機(jī)械痛閾值測(cè)定 在交變電磁場(chǎng)治療的第0、2、4、6、8周，分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行足底機(jī)械痛閾值的測(cè)定。測(cè)量前，將大鼠放置于金屬網(wǎng)中，其上方設(shè)有透明樹(shù)脂玻璃罩，令大鼠充分適應(yīng)環(huán)境30 min。待充分安靜后，使用Von Frey纖維絲刺激大鼠后足中央，刺激過(guò)程中或移開(kāi)纖維絲瞬間，大鼠出現(xiàn)明顯的抬足、躲避、舔腳等反應(yīng)，將此次測(cè)量定義為陽(yáng)性，記錄動(dòng)作發(fā)生的時(shí)間。每一標(biāo)號(hào)的纖維對(duì)每側(cè)足底刺激5次，即雙側(cè)10次，如出現(xiàn)5次以上陽(yáng)性反應(yīng)，則記錄該纖維力度。如果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)5次不抬腿的情況，則更換更高刻度的纖毛。

1.3.4熱痛閾值測(cè)定 在交變電磁場(chǎng)治療的第0、2、4、6、8周，分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行足底熱痛閾值的測(cè)定。測(cè)量前，將大鼠置于獨(dú)立的有機(jī)玻璃籠中，令其充分適應(yīng)30 min。使用熱輻射測(cè)痛儀對(duì)大鼠足底中部行熱光束照射，大鼠因無(wú)法耐受熱痛出現(xiàn)抬足反應(yīng)，此時(shí)光束會(huì)自動(dòng)切斷并自動(dòng)記錄反應(yīng)時(shí)間。每只大鼠的每側(cè)足底共刺激5次(雙側(cè)共10次)，每次間隔10 min，記錄10次測(cè)量值并取其平均值。

1.3.5脊髓細(xì)胞因子基因表達(dá)測(cè)定 交變電磁場(chǎng)干預(yù)8周后，通過(guò)使用腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉溶液處死各組大鼠。通過(guò)RNA提取試劑盒提取腰段脊髓L5背角總RNA，以2 μg RNA為上樣量，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟在20 μL反應(yīng)體系中對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對(duì)所選目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1所示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系：cDNA模板1.6 μL，上、下引物(濃度為10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，最后使用去離子水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20.0 μL。具體反應(yīng)條件：95 ℃變性處理3 min，95 ℃、60 ℃各30 s，循環(huán)40次后，進(jìn)行55 ℃退火處理15 s。每種基因設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，使用2-ΔΔCt對(duì)IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

表1 本實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中所使用的引物序列

2 結(jié) 果

2.1全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)于T2DM大鼠隨機(jī)血糖的影響 與對(duì)照組大鼠相比，T2DM組及T2DM+EMF組大鼠的隨機(jī)血糖值在實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、6、8周均明顯升高(P<0.001)。T2DM+EMF組的隨機(jī)血糖值在交變電磁場(chǎng)刺激的第0、2、4、6、8周與T2DM組大鼠相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠隨機(jī)血糖的影響

2.2全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠足底機(jī)械痛閾值的影響 T2DM組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、6、8周均明顯低于對(duì)照組大鼠(P<0.001)。T2DM+EMF組大鼠在交變電磁場(chǎng)干預(yù)之前(第0周)的足底機(jī)械痛閾值與T2DM組大鼠相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，T2DM+EMF組大鼠在實(shí)驗(yàn)第2、4、6、8周的足底機(jī)械痛閾值均明顯高于T2DM組大鼠(P<0.01)。T2DM+EMF組大鼠在實(shí)驗(yàn)第0、2、4、6周的足底機(jī)械痛閾值均明顯低于對(duì)照組大鼠(P<0.05)，但是T2DM+EMF組與對(duì)照組大鼠的足底機(jī)械痛閾值在第8周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠足底機(jī)械痛閾值的影響

2.3全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠足底熱痛閾值的影響 T2DM組及T2DM+EMF組大鼠在第0、2、4、6、8周的足底熱痛閾值均明顯低于對(duì)照組(P<0.001)。T2DM+EMF組大鼠在第0周的足底熱痛閾值與T2DM組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但T2DM+EMF組大鼠在實(shí)驗(yàn)第2、4、6、8周的足底熱痛閾值均明顯高于T2DM組(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠足底熱痛閾值的影響

2.4全身正弦交變電磁場(chǎng)對(duì)T2DM大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表達(dá)的影響 T2DM組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而NGF基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組大鼠(P<0.05)。T2DM+EMF組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達(dá)水平明顯低于T2DM組大鼠(P<0.05)，而其脊髓NGF的基因表達(dá)水平明顯高于T2DM組大鼠(P<0.05)。但是，對(duì)照組與T2DM+EMF組大鼠之間的脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 全身正弦波交變電磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)T2DM大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6和NGF基因表達(dá)的影響

3 討 論

隨著20世紀(jì)70年代Bassett首次應(yīng)用電磁場(chǎng)成功治療骨折與骨不連的延遲愈合，電磁場(chǎng)的非熱生物學(xué)效應(yīng)日益得到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。而被學(xué)者們所認(rèn)可且廣泛使用的電磁場(chǎng)治療場(chǎng)包括脈沖電磁場(chǎng)、正弦波交變電磁場(chǎng)以及穩(wěn)恒磁場(chǎng)。其中正弦波交變電磁場(chǎng)由于可以直接由市電直接轉(zhuǎn)換得到，因此憑借其簡(jiǎn)單易得、所輸出的電磁設(shè)備成本相對(duì)較低的優(yōu)勢(shì)，得到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究人員的廣泛關(guān)注。研究表明，正弦波交變電磁場(chǎng)對(duì)于促進(jìn)皮膚損傷愈合、加速骨創(chuàng)傷修復(fù)、改善微循環(huán)以及抑制腫瘤生長(zhǎng)等具有積極治療效果[8-9,12-13]。近年來(lái)，一些研究也發(fā)現(xiàn)正弦波交變電磁場(chǎng)具有明顯的消炎和鎮(zhèn)痛效應(yīng)[10-11]。但是，正弦波交變電磁場(chǎng)對(duì)于糖尿病引起的神經(jīng)病理性疼痛的作用效果及機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道，而其對(duì)于發(fā)生率更高的T2DM所誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛則更具臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究使用高糖高脂飲食飼喂8周并結(jié)合以低劑量STZ腹腔注射的方式構(gòu)建T2DM大鼠動(dòng)物模型，該實(shí)驗(yàn)步驟與方法已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者們使用，并被證實(shí)能夠成功誘導(dǎo)T2DM動(dòng)物模型[14-15]。該動(dòng)物模型也被認(rèn)為是迄今最為經(jīng)典的誘發(fā)型T2DM動(dòng)物模型，被廣泛用于T2DM及其并發(fā)癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，該方法所誘導(dǎo)的大鼠具有高血糖、肥胖、多飲、多食、多尿等特征，與臨床T2DM患者的癥狀一致。更重要的是，本研究行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果揭示，T2DM組大鼠相比于對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值明顯降低，而這與臨床T2DM神經(jīng)病理性疼痛患者對(duì)于外部刺激疼痛承受能力降低的現(xiàn)象一致，提示糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型構(gòu)建成功。而經(jīng)過(guò)全身正弦波交變電磁場(chǎng)暴露的大鼠，其足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值在刺激的第2周起就明顯高于無(wú)電磁輻照的T2DM大鼠，且這對(duì)疼痛閾值的改善隨著治療進(jìn)程的推進(jìn)則越為顯著，本研究結(jié)果提示交變電磁輻照療法對(duì)于T2DM神經(jīng)病理性疼痛具有改善作用。

在T2DM神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，脊髓炎性反應(yīng)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[17]。IL-1β、TNF-α和IL-6作為最常見(jiàn)的促炎因子，已被證實(shí)在T2DM神經(jīng)病理性疼痛脊髓中具有明顯的高表達(dá)特性[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制脊髓中這些炎癥因子的表達(dá)，能夠明顯改善糖尿病神經(jīng)病理性疼痛癥狀[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖高脂飲食誘導(dǎo)的T2DM大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達(dá)水平明顯高于非糖尿病大鼠，這與先前的臨床結(jié)果保持一致。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)全身交變電磁場(chǎng)治療8周后，T2DM大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表達(dá)水平均明顯降低。本研究結(jié)果提示，交變電磁場(chǎng)輻照療法具有明顯的抑制脊髓神經(jīng)炎癥的作用效果。其次，NGF是一種具有重要神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞因子，對(duì)于促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)具有重要作用，而機(jī)體NGF表達(dá)的改變會(huì)誘發(fā)神經(jīng)元的功能障礙和死亡[20]。有研究也發(fā)現(xiàn)外源性施加NGF對(duì)于改善神經(jīng)病理性疼痛癥狀具有積極效果[21]。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM組大鼠脊髓中NGF基因表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組大鼠，這與先前的研究結(jié)果保持一致[22]；當(dāng)經(jīng)過(guò)電磁場(chǎng)治療8周后，T2DM脊髓中NGF基因表達(dá)水平明顯增加，提示交變電磁場(chǎng)對(duì)于促進(jìn)脊髓中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)具有正向調(diào)控作用。

綜上所述，全身性的正弦波交變電磁場(chǎng)輻照療法能夠明顯改善高糖高脂飲食所誘導(dǎo)的T2DM大鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀，而這一效應(yīng)與其抑制脊髓神經(jīng)炎癥和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)有關(guān)。作為一種無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、安全的物理治療手段，全身性的正弦波交變電磁場(chǎng)有望成為臨床治療T2DM神經(jīng)病理性疼痛這一棘手問(wèn)題的有效途徑。