中心組合設計效應面法優化連翹中連翹苷的提取工藝

岑少婷，李植桐

（1.佛山市三水區婦幼保健院，廣東佛山 528100；2.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院），廣東廣州 510095）

連翹是清熱解毒類中藥方劑中的常用藥味，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等作用，研究表明連翹提取物、流浸膏等單味藥制劑對對感冒發熱、丹毒、營衛不調等癥也有較好的療效，且經提取制備單方制劑后便于攜帶、服用，療效更佳[1-3]。但與此同時，由于各醫療機構和制藥企業儀器設備、人員、工藝水平等因素的影響，所制備的連翹提取物療效和穩定性相差較大，因此有必要對該藥味的提取工藝中的關鍵參數進行優化和評價。

中心組合設計效應面法基于軟件計算和預測，可以根據用戶所給參數及范圍進行多參數/指標優化考察，相比傳統的單因素設計等方面，能夠最大限度減少試驗次數，獲得更加準確的結果[4-5]。因此，筆者擬使用Design Expert 軟件進行實驗設計，并根據所得各關鍵參數制備樣品，參考文獻方法測定連翹提取液中連翹苷的含量[6-7]，再導入上述軟件中預測最優結果。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀，配制為PDA檢測器，自動進樣器、四元高壓泵和柱溫箱，購自美國Waters公司；98-2-C型數顯電熱套，購自廣東佛衡儀器有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋，購自江蘇國華電器有限公司；ME104T/02 電子分析天平，購自瑞士Mettler-Toledo 公司；連翹苷對照品（批號：110821-201816）購自中國食品藥品檢定研究院；連翹苷藥材購自華潤三九藥業股份有限公司；樣品制備用乙醇為分析純，購自廣州化學試劑廠；供試品制備和含量測定用乙醇、乙腈、冰醋酸為色譜純，購自德國Merck公司；實驗用水購自Watsons公司。

2 方法與結果

2.1 實驗參數設計 本研究確定的考察乙醇含量、提取時間、溶劑量三個參數，考察指標為連翹苷含量。將各考察參數輸入Design Expert 軟件中，乙醇含量范圍設定為20%～100%，提取時間范圍設定為20～90min，溶劑量范圍設定為10～40 倍（溶劑體積/藥材量，藥材量固定為2g），系統給出的各實驗組參數見表1。根據所給參數進行加熱回流提取，所得提取液放冷后備用。

表1 CCD各組參數及測定結果

2.2 對照品溶液制備 取連翹苷對照品粉末，精密稱取約5mg 置于5mL 量瓶中，加色譜純乙醇溶解并定容至刻度，得濃度為1mg/mL的對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備 取各實驗組樣品，在水浴鍋上濃縮至≤20mL，所得溶液轉移至25mL 量瓶中，加色譜純乙醇稀釋并定容至刻度，即得連翹苷標準提取液；分別精密吸取上述提取液1mL，轉移至10mL 量瓶中，加色譜純乙醇稀釋并定容至刻度，所得溶液濾過，即得供試品溶液。

2.4 樣品含量測定 使用Waters Xbridge 色譜柱（25cm 柱長，0.46cm 內徑，5μm 粒徑），乙腈（A）-0.4%冰醋酸（B）為流動相，梯度程序為：0～15min，15%-15%A；15～20min，15%-90%A；20～25min，90%-15%A；25～30min，15%-15%A；流速1.0mL/min，檢測波長330nm，柱溫25℃，進樣體積10μL；記錄所得HPLC圖譜，見圖1。

圖1 對照品（100μg/mL）和供試品HPLC圖譜

2.5 含量測定方法驗證

2.5.1 線性和范圍 取連翹苷對照品溶液，分別精密吸取不同體積，轉移至多個5mL 量瓶中，加色譜純乙醇稀釋并定容，制得濃度分別為10、20、50、100、200、500μg/mL 的對照品溶液，注入HPLC 中，按“2.4”項下所述方法分析測定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，以峰面積為縱坐標（y）、濃度為橫坐標（x），導入Excel 軟件進行線性回歸，計算得回歸方程為y=14532x-1776.1（r2=0.9996）。結果顯示：方法線性良好，能夠在10～500μg/mL 濃度范圍內準確測定連翹苷的含量。

2.5.2 精密度考察 取最優提取條件制備的供試品溶液（簡稱供試品溶液），注入HPLC 中，按“2.4”項下所述方法分析測定，連續重復6次，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示：RSD為0.84%，表明方法精密度良好。

2.5.3 穩定性考察 將供試品溶液放置在HPLC自動進樣器中，分別在0、2、4、6、8、12h 按“2.4”項下所述方法分析測定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示：RSD為0.62%，表明方法所制備樣品在12h內穩定性良好。

2.5.4 重復性考察 平行配制6 份供試品溶液，按“2.4”項下所述方法分析測定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計算峰面積的RSD。結果顯示：RSD 為0.65%，表明方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收試驗 精密吸取標準提取液0.5mL，轉移至10mL量瓶中，按表2所列藥量添加連翹苷對照品溶液，混合后加色譜純乙醇稀釋并定容至刻度，所得溶液濾過，即得供試品溶液。吸取上述供試品溶液，注入HPLC 中，按“2.4”項下所述方法分析測定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計算含量、回收率和回收率的RSD。結果顯示：平均回收率為99.12%，RSD為3.13%，表明方法準確度良好。

表2 加樣回收試驗結果（n=3）

2.6 樣品測定和數據分析 取“2.1”項下各組樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，所得溶液注入HPLC中，按“2.4”項下所述方法分析測定，記錄各樣品中連翹苷的峰面積，計算含量。所得結果導入Design Expert 中，計算并預測最優提取參數。結果顯示：乙醇含量60%、提取時間60min、溶劑量為藥材量30 倍時為最優，為0.6152mg/mL，與軟件預測結果（圖2）相符。

圖2 中心組合設計效應面預測結果（n=20）

3 討論

含量測定結果顯示，中心點各組所得樣品連翹苷含量最高。產生上述結果，可能是由于：（1）乙醇含量增加時，提取效率上升，但該參數超過中心點后，由于黏度、極性的變化，導致連翹苷溶解度下降；此外含水量較高時，加熱回流會導致連翹苷水解，也會一定程度降低得率；（2）隨著提取時間延長，連翹苷提取量上升，但由于水解的存在，導致過度延長提取時間時，連翹苷水解量增加，進而影響產量；（3）增加液料比（溶劑-藥材比）可以使藥材得到充分提取，但其結果受藥材中連翹苷總量的影響，因此產量不會隨溶劑量的增加而無限增加。綜合考慮上述因素，最終選擇了中心點作為最優提取參數。

研究表明，使用不同極性溶劑對連翹進行提取時，所得提取物的抗炎活性存在較大差異；同時，該藥材水提物雖然提取率較高，且對小鼠足節腫脹模型具有一定抗炎效果，但與模型組相比并無統計學差異[8]。上述結果表明，在優化提取效率時，考察指標的選擇尤為關鍵。另有文獻報道顯示，連翹提取物與揮發油協同作用，均能夠顯著降低體內發熱相關炎癥因子（PEG2、ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α 等）水平，進而發揮解熱抗炎功效。結合連翹苷的藥理活性及文獻報道的連翹抗炎物質基礎可知，連翹醇提物對發熱型炎癥的抵抗效果較好[10-11]，且醇提物相較乙酸乙酯、正丁醇等有機溶劑毒性低，溶劑殘留導致的健康風險更加可控，因此本文選擇使用乙醇作為提取溶劑的有機相，具有較好的科學性、合理性。