中華倒刺鲃和胭脂魚游泳行為、應激和免疫能力對短期禁食的響應

周龍艷,李秀明,付世建

重慶師范大學進化生理與行為學實驗室, 重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶 401331

近些年來,我國長江流域各種魚類種群數量下降較為嚴重,其原因主要包括洄游通道阻隔、產卵場消失和過度捕撈等[1]。此外,三峽大壩的修建導致水體生境發生巨大變化,魚類能否在生理和行為上適應這些生境變化直接影響其種群動態以及增殖放流的效果[1—3]。先前的研究表明,巖原鯉(Procyprisrabaudi)、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)和胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)等長江魚類的行為特征和生理表現對環境生態因子變化的響應明顯不同[1—2, 4]。長江流域水生環境食物資源變動劇烈,相關研究鮮見報道。因此,本文旨在研究短期禁食脅迫下不同魚類的生理和行為響應策略。

在食物資源不足時,生物體面臨降低生理功能、減少活動和維持一定活動水平和生理功能去覓食和避敵的兩難選擇[1,4—5]。魚類在長期進化歷程中為了適應所處生境食物資源變動會形成不同的生理和行為調節策略[1,4—7]。當魚類遭遇饑餓環境時,其應激反應能力、免疫系統調節和抗氧化能力十分重要[1, 3]。在維持應激導致的內環境穩態和基礎耗能等方面,皮質醇通常具有顯著的作用[1, 8],當饑餓脅迫時,魚類一般會上調皮質醇水平用以動員能量供給[1, 9],上調溶菌酶相關基因表達水平[10—13]；而隨著病原體侵入,魚體免疫球蛋白M(IgM)等特異性免疫指標也可能明顯提高；此外,超氧化物歧化酶(SOD)是魚體抗氧化系統的主要酶類之一[14]。在脅迫條件下由于器官抗氧化物質儲存減少和活性氧自由基增加[15],魚類SOD可能上調其基因表達水平[1,16—17],這將導致更多能量的消耗,假如沒有及時且足夠的食物資源補充,將會導致其免疫功能的損傷和已有能量的耗盡。當遭遇饑餓脅迫時,魚體自身相關生理功能和行為調節能力對其生存適合度至關重要[1, 4—5]。

為了系統探討在短期禁食脅迫條件下魚類行為、免疫和生理等功能的響應及其內在聯系,本研究采用中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚為對象。目前這兩種魚類的野生種群數量稀少[18]。中華倒刺鲃是我國特有的一種鯉形目鯉科魚類,偏好急流且清澈水體生境；胭脂魚是一種鯉形目亞口魚科魚類,是該科分布在我國的唯一物種,也是我國的二級保護動物,偏好下層緩流水體生境[2,4,18]。中華倒刺鲃是以植物為主的雜食性魚類,而胭脂魚為底棲動物為主的雜食性魚類,兩種魚類在食物缺乏時可能表現出不同的行為和生理響應。本研究測定了禁食1周和禁食2周兩種魚類血清SOD活性、皮質醇水平、IgM水平和溶菌酶含量的變化。由于運動、免疫和機體的應激反應密切關聯且均導致機體能量的大量消耗,本研究還測定了短期禁食后兩種魚類游泳能力和群體自發游泳行為。本研究旨在系統探討中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚對短期禁食的生理和行為響應機制及其內在聯系,以期為魚類養殖實踐和資源保護提供必要的參考資料。

1 材料與方法

1.1 馴養與短期禁食處理

本實驗所用的中華倒刺鲃與胭脂魚幼魚從重慶市永川區水產養殖場購買獲得,每種實驗魚140尾,在室內循環水凈化控溫養殖水槽中馴養2周,水體溫度控制在(25±1)℃,用商品飼料每天飽足投喂2次(09:30和17:00),攝食1h后清除糞便與剩余餌料[1]。用充分曝氣并控溫后的自來水作為養殖用水,養殖水體溶氧飽和度控制在90%以上,每天更換總體水量的20%[1]。馴養2周以后,將每種實驗魚隨機分成正常攝食1周對照組、禁食1周處理組、正常攝食2周對照組和禁食2周處理組,每組35尾(3個重復,分別為12、12、11尾),并測量其初始體重和體長。所有實驗魚分別在處理1周或2周結束后禁食24h,隨后測定相關指標[1]。

1.2 最大均加速游泳速度(Ucat)

本實驗采用Blazka式魚類游泳測定儀測定最大均加速游泳速度[1,3—4,19]。具體操作簡要介紹如下：將單尾實驗魚轉入儀器中適應馴化 1 h,儀器中水流速度約為 6 cm/s。隨后,將儀器中的水流速度以0.167 cm/s2的恒定加速度持續增加,直至實驗魚力竭,此時的流速即為魚的Ucat值[1]。當實驗魚無力前進游泳,并停留在儀器末端篩板20s以上為力竭狀態的評判標準。游泳速度用相對游泳速度(體長/秒,BL/s)表示[1]。每組實驗魚測定9尾。

1.3 集群行為

實驗魚集群行為在一個有機玻璃板組成的水槽中進行,水槽的長、寬和高分別為70cm、37.5cm和35cm,水體深度為6cm[1, 4—5]。用高清攝像頭(與監測器相連)記錄其集群行為。用不透明白色紗布將水槽四周圍起來,減少外界干擾對實驗魚集群行為的影響[1]。每種實驗魚分別隨機選取20尾(5個重復,每個重復4尾)。先將實驗魚放置于水槽中適應20min,隨后拍攝20min視頻。用Idtracer軟件分析視頻,獲得個體間平均距離(IID)、運動時間比(PTM)和運動時的速度中值[1,4—5,20—21]。

1.4 皮質醇

隨機選取兩種實驗魚各6尾,置于魚類麻醉專用藥(MS222)(0.1g/mL)中麻醉,斷尾取血,高速離心10min(3000r/min),取上清液備用[1]。各個指標取樣和樣品準備操作相同。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)原理和Cayman試劑盒以及酶標儀測定皮質醇水平[1]。

1.5 免疫球蛋白(IgM)

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)原理和南京建成生物研究所生產的試劑盒以及酶標儀測定IgM水平[1]。

1.6 溶菌酶

采用紫外分光光度計(530nm波長)和南京建成生物研究所生產的試劑盒測定溶菌酶含量[1]。公式如下[1]：

溶菌酶含量(μg/mL)=(測定透光度UT2-測定透光度UT0)/(標準透光度ST2-標準透光度ST0)×

稀釋倍數×標準品濃度

(1)

1.7 超氧化物歧化酶(SOD)

采用紫外分光光度計(550nm波長)和南京建成生物研究所生產的試劑盒測定SOD活力[1]。公式如下[1]：

SOD活力(U/mL)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度/50%×稀釋倍數 (2)

1.8 統計分析

本研究數據統計分析采用Excel(2003)和SPSS 17.0軟件。采用t-test對體重和體長差異進行分析。采用一般線性模型單變量的三因素協方差分析短期禁食、魚的種類和禁食時間對其他指標的影響(除了游泳速度中值用體長作協變量以外,其它指標用體重作協變量)。群體游泳以短期禁食、魚的種類和禁食時間為主因子,編號作為隨機變量進行線性混合模型統計。假如方差分析檢驗通過,用Duncan′s多重比較分析不同的短期禁食組之間、不同的禁食時間點以及不同的魚類之間的差異。以平均值±標準誤(Mean ± SE)表示數據值,P<0.05為顯著性水平。

2 結果

2.1 短期禁食對兩種實驗魚魚體大小的影響

攝食對照組中華倒刺鲃幼魚1周體長顯著增加3.76%,2周體長顯著增加6.74%(P<0.001),禁食組中華倒刺鲃幼魚體長與實驗前沒有顯著變化；攝食對照組胭脂魚幼魚1周體長增加3.47%(P=0.008),2周體長增加2.67%(P=0.094),禁食組胭脂魚幼魚體長與實驗前沒有顯著變化(P>0.05)(表1)。

表1 短期禁食處理對中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚魚體大小的影響(平均值±標準誤,N= 35)

攝食對照組中華倒刺鲃幼魚體重1周顯著增加7.86%(P=0.014),2周顯著增加12.12%(P<0.001),禁食組中華倒刺鲃幼魚體重1周降低4.05%(P=0.231),2周降低10.09%(P<0.001)；攝食對照組胭脂魚幼魚體重與實驗前相比沒有顯著性差異,禁食組胭脂魚幼魚1周體重降低3.33%(P=0.321),2周體重降低4.48%(P=0.233),但都與實驗前沒有顯著變化。

2.2 短期禁食對兩種實驗魚魚群自發游泳行為和運動能力的影響

胭脂魚幼魚的Ucat顯著低于中華倒刺鲃幼魚(P<0.001),不過短期禁食對兩種實驗魚的Ucat都沒有產生顯著性的影響(表2,圖1)。

表2 短期禁食、魚的種類和禁食時間對最大游泳速度、溶菌酶、免疫球蛋白、超氧化物歧化酶和皮質醇的三因素協方差統計分析表

圖1 短期禁食對中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚群體自發游泳行為和運動能力的影響(平均值±標準誤,自發行為：N=5,Ucat：N=9)Fig.1 The effects of short-term fasting on variables of maximum acceleration swimming speed and spontaneous shoal behaviour in S. sinensis and M. asiaticus (Mean±SE, N=5 for spontaneous behaviour and N=9 for Ucat)a和b表示兩種實驗幼魚之間差異顯著, * 表示攝食對照組和禁食處理組實驗幼魚之間差異顯著

中華倒刺鲃幼魚的自發游泳速度中值總體上低于胭脂魚幼魚,但僅僅在2周對照組實驗魚之間存在顯著性差異(表3,圖1)。胭脂魚幼魚的PTM顯著低于中華倒刺鲃幼魚,但短期禁食處理對兩種實驗魚的PTM都沒有顯著性影響。胭脂魚幼魚的IID顯著短于中華倒刺鲃幼魚,且兩種實驗魚攝食對照組的IID都顯著小于禁食處理組(P<0.001)。

表3 短期禁食、魚的種類和禁食時間對游泳速度中值、個體間距離和運動時間比的線性混合模型統計分析表

2.3 短期禁食對兩種實驗魚免疫指標和皮質醇的影響

兩種實驗魚皮質醇水平之間無顯著性差異,但是1—2周短期禁食對血清皮質醇水平有顯著性的影響(P<0.001)(圖2)。兩種實驗魚短期禁食后皮質醇水平整體上升,但胭脂魚幼魚上升幅度不及中華倒刺鲃幼魚(交互作用:P=0.009)。胭脂魚幼魚血清的IgM水平顯著低于中華倒刺鲃幼魚(P=0.005),1—2周短期禁食導致中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚的IgM水平都顯著性提高(P<0.001),并且胭脂魚IgM水平提高沒有中華倒刺鲃明顯(P=0.018)(圖2)。1—2周短期禁食對溶菌酶的影響在兩種實驗魚之間存在差異(P=0.004)：兩種實驗魚對照組之間沒有顯著性不同,1—2周短期禁食對中華倒刺鲃幼魚血漿溶菌酶水平的影響不顯著,但是使胭脂魚幼魚溶菌酶水平顯著提高；1—2周短期禁食組胭脂魚幼魚溶菌酶水平顯著低于中華倒刺鲃幼魚(圖2)。中華倒刺鲃幼魚的SOD水平顯著低于胭脂魚幼魚(P=0.009),中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚SOD水平沒有受到短期禁食處理的影響(圖2)。

圖2 短期禁食對中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚抗氧化和免疫指標的影響(平均值±標準誤,N=6)Fig.2 The effects of short-term fasting on antioxidant and immune variables of S. sinensis and M. asiaticus (Mean±SE,N=6)

3 討論

3.1 中華倒刺鲃和胭脂魚的種間差異

中華倒刺鲃和胭脂魚在行為特征和生理功能上差異明顯[1,4,11, 20]。中華倒刺鲃幼魚的游泳速度比胭脂魚幼魚高出10%—20%,PTM和IID都高出100%左右。由此表明,胭脂魚擁有更低的游泳能力和不太活躍的行為特點[1,2,6,11]。胭脂魚較差的游泳能力可能與其體背較高,游泳阻力相對比較大有關[1—3]。胭脂魚還表現出更低的IgM水平,IgM和皮質醇對1—2周短期禁食脅迫的響應不太明顯。由此表明,作為一種偏好緩流的魚類,胭脂魚生理功能可能并沒有維持在較高的基礎狀態[1,22]。即使在食物供給充足的情況下,胭脂魚生長相對緩慢,但是其體重在食物缺乏情況下損失較小[1]。不過,胭脂魚的SOD活性比中華倒刺鲃高。由此表明,相比之下胭脂魚幼魚生理功能側重對氧化自由基的處理。這可能與兩種魚類的生理特點、生存環境和生態習性差異有關[1,4, 11,20,23—24]。

3.2 中華倒刺鲃和胭脂魚對短期禁食的行為反應和生理響應

本研究發現,短期禁食(1—2周)導致中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚的體重下降約4%—7%,但促使兩種魚類自發游泳時IID都增加,可能是因為其增加搜索食物等行為導致群體凝聚力的降低[1, 4—5,19—20]。中華倒刺鲃和胭脂魚的游泳能力(Ucat)和PTM在1—2周短期禁食后沒有顯著性變化,這種研究結果在以往的研究中也被發現[1, 4,20,25]。魚類在短期食物缺乏的條件下維持其游泳能力有利于覓食等生理功能的實現,進而提高其生存適合度[1, 4—5]。此外,胭脂魚在短期禁食后其SOD酶活性并沒有顯著變化,甚至溶菌酶和IgM還有所增加。這可能有利于胭脂魚動員免疫和抗氧化功能維持其體內環境的穩定[1,9,26—29]。皮質醇在機體能量動員方面起著重要的作用[30],1—2周短期禁食導致中華倒刺鲃和胭脂魚的皮質醇水平都出現增加的趨勢,且胭脂魚的皮質醇上升顯著低于中華倒刺鲃,由此表明胭脂魚在面臨短期食物不足時對能量的動員可能不如中華倒刺鲃[1]。這也可以從短期禁食導致胭脂魚IgM水平的上升顯著低于中華倒刺鲃的結果得到佐證[1,31—32]。本研究發現,在1—2周短期禁食條件下胭脂魚幼魚溶菌酶含量明顯增加,這可能與其底棲生活環境中病原體比較多有關[1,33]。

禁食脅迫可能導致魚類溶菌酶含量、皮質醇水平和SOD活性下降、不變或者上升[1,8, 10—12],這可能與魚類禁食時間長短和不同魚類應激反應、抗氧化功能和免疫水平的種間差異相關[1]。本研究發現中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚應對1—2周短期禁食脅迫時在生理響應和行為反應上種間差異明顯。這可能與兩種魚類之間基礎生理狀態和饑餓脅迫下應激調節的差異相關,進而可能導致中華倒刺鲃和胭脂魚在相同的環境因子變動條件下出現不同的種群數量變動[1, 11]。