外周血Th17/Treg失衡與兒童免疫性血小板減少癥嚴重程度及預后的關系

黃寶山

免疫性血小板減少癥是一類獲得性自身免疫性疾病，高發于兒童，以血小板減少及出血為主要臨床特征[1]。由于兒童免疫性血小板減少癥的發病機制尚未明確，缺乏根治性療法，首選對癥止血治療，然而整體效果并不十分理想。一直以來，臨床學者致力于尋找與兒童免疫性血小板減少癥密切相關的指標，期望為準確評估病情提供依據，給此病的治療帶來啟示。近年來，國內外研究顯示，兒童免疫性血小板減少癥的發生、發展與免疫功能異常導致的炎癥反應有關[2-3]。鑒于輔助性T淋巴細胞17（Th17）和調節性T淋巴細胞（Treg）均是調控免疫應答過程的CD4+效應T細胞，而已有研究表明，免疫性血小板減少癥患兒Th17細胞和Treg細胞分泌的細胞因子水平波動明確[4]。由此推測，外周血Th17/Treg失衡可能是導致兒童免疫性血小板減少癥的啟動因素，然而外周血Th17/Treg失衡是否與患兒的病情嚴重程度有關，對預后的評估價值如何，均有待明確，且相關研究鮮有報道。對此，本研究目的在于分析外周血Th17/Treg失衡與兒童免疫性血小板減少癥嚴重程度及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取徐州市兒童醫院2017年1月-2021年9月接診的65例免疫性血小板減少癥患兒作為研究對象。納入標準：（1）年齡2～14歲；（2）符合文獻[5]《兒童原發性免疫性血小板減少癥診療規范（2019年版）》關于此病的診斷標準；（3）首次發病，病程不超過60 d，接受常規一線治療；（4）患兒配合治療、檢查和隨訪。排除標準：（1）合并感染性疾病、惡性腫瘤、其他血液系統疾病、其他免疫系統疾病；（2）入組前接受輸血及提升血小板治療；（3）長期接受免疫調節劑治療。根據病情嚴重程度，將其分為重型組（30例，血小板計數＜10×109/L）和非重型組（35例，血小板計數≥10×109/L）。重型組男13例，女17例；年齡2～14歲，平均（3.62±0.83）歲；病程2～60 d，平均（14.38±1.71）d。非重型組男17例，女 18例；年齡2～14歲，平均（3.71±0.76）歲；病程 2～60 d，平均（14.35±1.68）d。兩組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準，患兒監護人知悉研究內容，簽署知情同意書。

1.2 方法

所有患兒均予以丙種球蛋白和糖皮質激素治療，靜脈滴注丙種球蛋白（1 g/kg，共1次）聯合甲基潑尼松龍[10 mg/（kg·d），每隔3天劑量減半，共 9 d]，繼之口服潑尼松 [1.5～2.0 mg/（kg·d）]，持續治療1～2個月逐漸減量，總療程3個月。所有患兒均檢測外周血指標及炎癥因子水平，在治療前 1 d，采集 2 份 5 ml靜脈血，其中 5 ml血樣經抗凝處理，分離提取外周血單個核細胞并制作細胞懸液，分為兩份，分別用于檢測Th細胞和Treg細胞。往細胞懸液加入異硫氰酸熒光素標志的抗人CD8單抗和葉綠素蛋白耦聯物標志的抗人CD3單抗各5 μl，經孵育、固定、洗滌等處理后，使用美國BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀檢測外周血Th細胞。往細胞懸液加入異硫氰酸熒光素標志的抗人CD4單抗、藻紅蛋白標志的抗人CD127單抗、葉綠素蛋白耦聯物標志的抗人CD25單抗共20 μl，經混勻、避光孵育等處理后，流式細胞儀檢測Treg細胞。計算外周血指標（Th17細胞和Treg細胞比例及外周血Th17/Treg比值）。另外5 ml血樣予以抗凝處理，離心處理，分離血清，使用酶聯免疫吸附試驗檢測炎癥因子（血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17）水平，檢測試劑盒均來源于上海生物芯片有限公司，檢測結果使用美國MD全波長酶標儀讀取。

1.3 觀察指標及評價標準

比較重型組和非重型組外周血指標（Th17細胞和Treg細胞比例及Th17/Treg比值）、炎癥因子（血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17）。使用Pearson相關性分析外周血Th17/Treg比值與血小板計數、起效時間的關系（以血小板計數≥10×109/L且較治療前至少升高1倍作為判斷起效的依據）。并根據病情是否緩解，對患者進行分組，以血小板計數≥10×109/L且較治療前至少升高2倍，無出血表現作為判斷病情緩解的依據[6]。比較緩解組與未緩解組治療前1 d外周血指標。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析和處理，符合正態分布且方差齊性的計量資料以（±s）表示，兩組間采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，兩組間采用χ2檢驗，使用Pearson相關性分析外周血Th17/Treg比值與血小板計數、起效時間的關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重型組和非重型組外周血指標比較

重型組外周血Th17細胞比例、Th17/Treg比值均高于非重型組，Treg細胞比例低于非重型組（P＜0.05），見表 1。

表1 重型組和非重型組外周血指標比較（±s）

表1 重型組和非重型組外周血指標比較（±s）

組別 Th17細胞（%）Treg細胞（%）Th17/Treg比值非重型組（n=35） 14.86±2.73 8.12±2.32 1.98±0.34重型組（n=30） 20.15±3.98 5.37±1.09 4.12±0.65 t值 6.321 5.949 16.971 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 重型組和非重型組炎癥因子比較

重型組血清IL-4、IL-10水平均低于非重型組，IL-6、IL-17水平均高于非重型組（P＜0.05），見表2。

表2 重型組和非重型組炎癥因子比較[ng/L，（±s）]

表2 重型組和非重型組炎癥因子比較[ng/L，（±s）]

組別 IL-4 IL-6 IL-10 IL-17非重型組（n=35） 26.84±5.69 91.25±12.47 149.75±35.84 1.98±0.76重型組（n=30） 3.18±0.73 121.46±25.83 74.61±16.92 6.74±3.05 t值 22.591 6.140 10.514 8.926 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 外周血Th17/Treg比值與血小板計數、起效時間的關系

在65例免疫性血小板減少癥患兒中，治療前血小板計數平均為（15.87±2.16）×109/L，起效時間平均為（2.15±0.67）d。經Pearson相關性分析，外周血Th17/Treg比值與血小板計數呈負相關（r=-0.784，P=0.000），與起效時間呈正相關（r=0.691，P=0.000），散點圖見圖1。

2.4 緩解組與未緩解組外周血指標比較

所有患兒均完成治療，在治療3個月內緩解52例，納入緩解組，未緩解13例，納入未緩解組。治療前1 d，緩解組外周血Th17細胞比例、Th17/Treg比值均低于未緩解組，Treg細胞比例高于未緩解組（P＜0.05），見表 3。

表3 緩解組與未緩解組外周血指標比較（±s）

表3 緩解組與未緩解組外周血指標比較（±s）

組別 Th17細胞（%）Treg細胞（%）Th17/Treg比值未緩解組（n=13） 19.04±3.72 5.41±1.29 3.62±0.51緩解組（n=52） 15.73±2.59 7.86±2.07 1.87±0.25 t值 3.022 5.372 11.965 P值 0.003 0.000 0.000

3 討論

兒童免疫性血小板減少癥的病因復雜，發病機制仍在探索中，治療手段缺乏針對性，因此準確評估病情嚴重程度并指導治療方案的制定，就顯得十分有必要。近年來，國內外研究顯示，兒童免疫性血小板減少癥可能與細胞免疫功能異常導致造血干細胞損傷有關[7-8]。Th17細胞可分泌致炎因子IL-6、IL-17，調控機體炎癥反應，誘導自身免疫性疾病發生、發展，Treg細胞具有免疫抑制作用，通過分泌抗炎因子IL-4、IL-10，發揮免疫抑制功能，維持免疫平衡。從本研究結果可知，重型組血清IL-4、IL-10水平均低于非重型組，IL-6、IL-17水平均高于非重型組（P＜0.05），初步揭示了重型免疫性血小板減少癥患兒機體存在外周血Th17/Treg失衡，導致血清致炎因子IL-6、IL-17和抗炎因子IL-4、IL-10表達異常。Guo等[9]研究表明，重型免疫性血小板減少癥患兒機體Th17細胞數量顯著增多，且明顯多于非重型患兒。也有研究表明，免疫性血小板減少癥患兒病情處于活動期時外周血Treg細胞表達水平明顯低于完全緩解期患兒[10]。由此推測，兒童免疫性血小板減少癥的病情嚴重程度可能與Th17/Treg比例失衡引起的免疫調節功能紊亂有關。在本研究中，重型組外周血Th17細胞比例、Th17/Treg比值均高于非重型組，Treg細胞比例低于非重型組（P＜0.05），與王明鏡等[11]的研究結果相符，揭示了外周血Th17/Treg比值與兒童免疫性血小板減少癥的病情演變有關，能在一定程度上用于判斷患兒的病情嚴重程度。與此同時，本研究使用Pearson相關性分析，結果顯示，免疫性血小板減少癥患兒外周血Th17/Treg比值與血小板計數呈負相關（r=-0.784，P=0.000），亦進一步佐證了上述觀點，提示外周血Th17/Treg比值與兒童免疫性血小板減少癥嚴重程度存在關聯。

盡管以激素與丙種球蛋白沖擊治療為主的一線治療方案已廣泛用于治療兒童免疫性血小板減少癥，但仍有高達20%的患兒病情進展至慢性或難治性階段，若能提前準確評估預后，指導治療，有望增加患兒的臨床獲益[12-13]。章大謙等[14]研究表明，激素結合免疫球蛋白沖擊療法能夠糾正外周血Th17/Treg失衡，抑制炎癥反應，進而達到治療免疫性血小板減少癥的目的。筆者認同上述觀點，并推測外周血Th17/Treg失衡程度可能是評價免疫性血小板減少癥患兒預后的理想指標。本研究通過Pearson相關性分析，結果顯示，免疫性血小板減少癥患兒外周血Th17/Treg比值與起效時間呈正相關（P＜0.05），提示外周血Th17/Treg失衡與免疫性血小板減少癥患兒的早期病理、生理過程有關，進而影響預后，具體作用有待深入研究予以明確。出現上述結果的原因，考慮在于免疫性血小板減少癥患兒外周血Th17/Treg失衡程度越大，自身抗體對血小板的破壞越嚴重并拮抗血小板生成，進而影響治療效果[15]。本研究中，所有患兒均完成治療，在治療3個月內緩解52例，納入緩解組，未緩解13例，納入未緩解組。治療前1 d，緩解組外周血Th17細胞比例、Th17/Treg比值均低于未緩解組，Treg細胞比例高于未緩解組（P＜0.05）。提示外周血Th17/Treg失衡可影響預后，有可能成為此病潛在的治療靶點。基于本研究結果，認為在免疫性血小板減少癥患兒的治療過程中，有必要強調免疫治療，通過抑制Th17增殖及其炎癥因子的合成、釋放，增強Treg細胞的分化活性，糾正外周血Th17/Treg失衡，達到控制病情，改善預后的目的。

綜上所述，外周血Th17/Treg失衡與兒童免疫性血小板減少癥嚴重程度存在關聯，有助于評估預后，可能成為早期評估病情的理想指標。當然，本研究存在樣本量不多、缺乏長期隨訪數據，未能分析外周血Th17/Treg失衡與患兒病情復發及遠期預后的關系，有待日后擴大研究規模，深入分析Th17/Treg失衡在兒童免疫性血小板減少癥發生、發展中的作用機制，將有助于研究結果的完善，為此病的診治提供高級別證據支持，可能是未來該領域研究的熱點。