臍環穴針刺法對慢性濕疹血虛風燥證患者SCOS3-JAK1/SATA5信號通路表達的影響*

謝玉華，徐晶，譚磊，賴菁菁，李婕，耿寶忠

廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

慢性濕疹（chronic eczema，CE）是臨床上最為常見的變態反應性慢性皮膚病，以反復發作的頑固性瘙癢、皮膚浸潤肥厚或呈苔蘚樣病變為特征，給患者身心健康造成極大的痛苦［1］。CE的發病機制與免疫炎癥因素和非免疫非炎癥因素都有密切關系，一般認為免疫應答引起的炎癥反應為該病首要效應機制［2］。研究發現，JAK/STAT信號通路在濕疹發病中起關鍵作用，特別是細胞因子信號轉 導抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）介導的蛋白酪氨酸激酶1（janus protein kinase 1，JAK1）/信號轉導與轉錄激活子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）炎癥通路。JAK/STAT5信號通路是一條由細胞因子刺激的信號轉導通路［3-4］，能啟動免疫炎癥反應，導致濕疹的發生。SOCS3是一類新型細胞因子信號傳導抑制分子，參與JAK/STAT3信號傳導途徑的負性反饋調節［3］。本研究檢測CE血虛風燥證患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中SOCS3、JAK1、磷酸化蛋白酪氨酸激酶1（phosphorylate janus protein kinase 1，pJAK1）、STAT5、磷酸化信號轉導與轉錄激活子5（phosphorylate signal transducer and activator of transcription 5，pSTAT5）蛋白表達量及血清白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白 細 胞 介 素10（interleukin-10，IL-10）水平，并觀察壯醫臍環穴針刺法的干預作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2017年7月至2018年6月在廣西中醫藥大學第一附屬醫院壯醫科門診就診的62例CE患者，按就診先后順序隨機分為觀察組和對照組，每組31例。治療過程中觀察組剔除3例，對照組剔除1例。觀察組28例中男16例，女12例；年齡26～67歲，平均年齡（45.22±9.53）歲；病程6～59個月，平均病程（21.23±11.74）個月；皮損位置：頭/頸5例，上肢9例，軀干8例，下肢6例。對照組30例中男16例，女14例；年齡29～62歲，平均年齡（44.35±9.45）歲；病程7～62個月，平均病程（22.64±11.68）個月；皮損位置：頭/頸4例，上肢10例，軀干9例，下肢7例。兩組患者基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。另選取26例醫院體檢正常者為正常組，其中男13例，女13例，年齡26～67歲，平均年齡（34.64±10.72）歲。

1.2 納入標準納入：1）符合中西醫診斷標準［5-6］者；2）年齡18～70歲者；3）無心腦血管、肝腎功能不全及其他嚴重器質性病變、慢性消耗性疾病及精神異常者；4）治療前半個月內未服用過含有皮質類固醇激素的藥物，治療前1周內未口服過抗組胺類抗過敏藥物或外用過類固醇激素制劑者；5）遵醫囑用藥，按時復診或接收電話訪問者；6）自愿參加本試驗，并在知情同意書上簽字者。

1.3 排除標準排除：1）濕疹并發感染或并發其他皮膚病或性病者；2）受試期間不遵醫囑抗拒治療者，或不能配合研究者；3）對本研究用藥成分過敏者；4）正在參加其他臨床研究者；5）準備妊娠、已經妊娠或哺乳期婦女。

1.4 脫落標準1）觀察中失訪者；2）因治療原因或非療效原因主動退出者；3）依從性差，不能按要求針刺或用藥者；4）發生嚴重不良事件，不宜繼續治療者。

1.5 治療方法

1.5.1 觀察組采用壯醫臍環穴針刺法治療。穴位定位參照《中國壯醫針刺學》［7］，取壯醫臍環穴、肘關穴（雙側）、膝關穴（雙側）、外水穴（雙側）、趾背穴（雙側）、內龍穴（雙側）。主穴：臍環穴包括臍內環穴與臍外環穴；臍內環穴：以臍窩內側緣作一圓環，環線上均是穴位，把臍內環當做一鐘表，常在1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12時8個點上取穴，習稱臍內環八穴；臍外環穴：以臍窩為圓心，以1.5寸（1寸≈3.33 cm）長度為半徑作一圓環，環線上均是穴位。一般取臍窩上、下、左、右共4穴，習稱臍外環穴。配穴：包括肘關穴（雙側）、膝關穴（雙側）、外水穴（雙側）、趾背穴（雙側）、內龍穴（雙側）；肘關穴：圍繞肘關節一圈為環，環線上均是穴位，一般取外側3穴和內側3穴，共6穴；膝關穴：圍繞膝關節一圈為環，環線上均是穴位，分前后兩側，一般每側各取3穴，共6穴；外水穴：在小腿外側面，于外踝尖上8寸內側緣，相當于中醫豐隆穴與條口穴連線的中點；趾背穴：足背第一跖趾關節中點取穴；內龍穴：在手腕內側正中線，腕橫紋上1.5寸。操作方法：囑患者取舒適體位，在上述穴位用碘伏常規消毒臍窩部及局部皮膚，選用一次性針灸針（吳江市云龍醫療器械有限公司），規格：0.25 mm×25 mm及0.25 mm×40 mm，依據穴位分布選擇不同長度規格的針灸針進行針刺，無補瀉手法，不強求針感，留針30 min后緩慢出針。注意事項：如針刺后出現皮下血腫，立即予以冰敷處理，24 h后可熱敷以活血散瘀。若患者在治療中出現暈針，給予對癥處理。重者，在上述基礎上，可刺人中、素髎、內關、足三里，灸百會、關元、氣海等穴。若患者仍不省人事，呼吸細微，脈細弱者，可考慮配合其他治療或采用急救措施。每日1次，療程為4周。

1.5.2 對照組復方甘草酸苷片（日本米諾發源制藥株式會社，國藥準字H20080182，規格：50 mg/片）口服，每次50 mg，每日3次，飯后口服，療程為4周，并外用糠酸莫米松乳膏（上海先靈葆雅公司，國藥準字H19991418，規格：15 g/支）均勻涂抹皮損處，然后用手指按揉促進吸收。每日2次，療程為4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 臨床療效［8］臨床痊愈：癥狀消失或基本消失，積分減少≥95%。顯效：癥狀明顯改善，70%≤積分減少＜95%。有效：癥狀有所改善，30%≤積分減少＜70%。無效：癥狀無改善或加重，積分減少＜30%。

1.6.2 EASI評分［9］根據皮損面積占各部位面積的比例計算分值，分值越高說明皮損面積越大。

1.6.3 VAS評分［10］無瘙癢：視覺模擬評分為0分；輕度瘙癢：視覺模擬評分為1～3分；中度瘙癢：視覺模擬評分為4～7分；重度瘙癢：視覺模擬評分＞7分。

1.6.4 PBMC中SOCS3、JAK1、STAT5蛋白表達水平抽取患者治療前后空腹肘靜脈血4 mL，而正常組患者則僅在治療前抽取空腹肘靜脈血4 mL，置于肝素抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離獲得PBMC［11］，置入-80℃凍存待測。PBMC總蛋白的提取：取上述PBMC標本，采用1×磷酸鹽緩沖液（PBS）洗兩次后，加入200μL含蛋白酶抑制劑cooktail（RIPA）強裂解液，冰上裂解30 min后，移入1.5 mL離心管，至4℃，離心半徑7.5 cm，12000 r/min離心20 min；取上清轉移至新的預冷的離心管中。Bradford法進行蛋白定量；取適量蛋白樣品加入等體積的上樣緩沖液，沸水煮5 min后，進行蛋白電泳。Western blot實驗：取各組分蛋白品各20μg，用12.5%SDS-PAGE凝膠進行蛋白分離，120 V電壓條件下電泳約90～120 min，采用濕式轉膜法使膠上的蛋白條帶電轉移到NC膜上，冰浴下，用恒壓100 V，轉膜2 h。取NC膜用麗春紅（Ponceau S）染色，觀察轉移效果后，用5%脫脂奶粉（TBST）室溫下封閉1 h，再用TBST洗膜5 min；加入兔抗人SOCS3多克隆抗體（1∶200稀釋）、JAK1多克隆抗體（1∶200稀釋）、pJAK1多克隆抗體（1∶200稀釋）、STAT5多克隆抗體（1∶200稀釋）及pSTAT5多克隆抗體（1∶200稀釋）（5種抗體均來源于美國CST公司），4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次。加入生物素標記的山羊抗人二抗（1∶200稀釋，來源于北京百奧萊博科技有限公司），37℃孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次；將膠片進行掃描，用GIS-300凝膠成像分析系統（南京馳順科技發展有限公司）分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.6.5 IL-4、IL-6、IL-10水平抽取患者空腹肘靜脈血5 mL，而正常組患者則僅在治療前抽取空腹肘靜脈血5 mL，采用ELISA檢測外周IL-4、IL-6、IL-10水平。檢測步驟嚴格按照試劑盒（華美生物公司）說明書進行操作。

1.6.6 安全性指標測定患者血、尿、糞三大常規及肝腎功能、電解質、心電圖等，記錄患者治療過程中出現的藥物不良反應發生情況。

1.7統計學方法采用SPSS 19.0軟件包進行數據處理。計量資料用±s表示，采用t檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床療效觀察組臨床痊愈2例，顯效12例，有效10例，無效4例，總有效率85.71%（24/28）；對照組顯效7例，有效11例，無效12例，總有效率60.00%（18/30）。兩組臨床療效比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 EASI及VAS評分與治療前相比，兩組EASI及VAS評分治療第2、4周后均明顯降低（P＜0.05），且治療后觀察組較對照組降低明顯（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組治療前后EASI及VAS評分比較（±s）分

表1 兩組治療前后EASI及VAS評分比較（±s）分

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組對照組例數28 30時間治療前治療后2周治療后4周治療前治療后2周治療后4周EASI評分12.23±1.58 8.14±0.85*#4.28±0.33*#12.16±1.64 10.18±0.93*6.47±0.56*VAS評分6.91±1.38 4.75±1.31*#2.61±1.18*#7.04±1.19 5.30±1.52*3.57±1.82*

2.3 PBMC中SOCS3、JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量觀察組及對照組治療前PBMC中SOCS3、JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量均高于正常組（P＜0.05）；治療后兩組PBMC中SOCS3蛋白表達水平均較治療前升高，而JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量較治療前降低，觀察組優于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組治療前后PBMC中SOCS3、JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量比較（±s） 分

表2 各組治療前后PBMC中SOCS3、JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量比較（±s） 分

注：*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別正常組觀察組對照組例數26 28 30時間治療前治療后治療前治療后治療前治療后SOCS3 0.40±O.02-0.45±O.04△0.55±O.06*#0.46±O.02△0.51±O.05*JAK1 0.60±0.01-0.89±0.12△0.64±0.05*#0.87±0.15△0.78±0.08*JAK1 0.44±O.03-0.67±O.03△0.57±O.03*#0.68±O.02△0.49±O.04*STAT5 0.38±0.02-0.61±0.09△0.42±0.07*#0.58±0.13△0.51±0.09*pSTAT5 0.29±0.02-0.45±0.02△0.36±0.01*#0.43±0.03△0.31±0.02*

2.4 血清IL-4、IL-6、IL-10水平觀察組及對照組治療前血清IL-4、IL-6、IL-10水平均高于正常組（P＜0.05），治療后兩組血清IL-4、IL-6、IL-10水平均較治療前降低（P＜0.05），且觀察組低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組治療前后血清IL-4、IL-6、IL-10水平變化（±s） pg/mL

表3 各組治療前后血清IL-4、IL-6、IL-10水平變化（±s） pg/mL

注：△表示與正常組比較，P＜0.05；*表示與同組治療前比較，P＜0.05；#表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別正常組觀察組對照組例數26 28 30 IL-4治療前34.25±17.22 55.97±6.19△56.78±6.80△治療后-39.77±4.89*#48.12±5.16*IL-6治療前5.93±3.20 16.35±4.71△16.28±4.76△治療后-6.27±3.04*#8.08±3.32*IL-10治療前10.69±6.51 27.08±6.60△27.45±6.42△治療后-14.17±4.56*#16.93±5.75*

2.5 不良反應兩組治療前后血、尿、糞三大常規及肝腎功能、心電圖等用藥安全性檢測指標均未發現明顯異常。觀察組有1例患者針刺后瘙癢較前加劇，但1～2 min后自行緩解；對照組有2例患者服藥后出現惡心不適，逐漸適應耐受后癥狀消失。

3 討論

CE是一種反復而難治的遲發型變態反應性皮膚病，該病與免疫系統功能的異常有著密切聯系。研究表明，濕疹的發生源自于PBMC中T細胞誘導的免疫機制的紊亂，特別是與輔助性T細胞亞群Th1/Th2細胞功能失衡相關，其嚴重程度與Th2細胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10等炎癥因子水平呈正相關性［12-14］。Th2細胞能有效地刺激并介導體液免疫及遲發性變態反應，其功能的亢進產生大量的細胞因子能阻止Th1細胞對其的抑制功能，同時可促進B細胞的增殖分化合成并分泌大量的IgE抗體，誘導免疫變態反應而導致皮膚黏膜濕疹樣病變［15-16］。

JAK/STAT是近年來發現的一條完整而廣泛存在的細胞因子信號轉導通路，參與調控細胞的增殖分化、免疫機制的調節及腫瘤的發生發展等多種生理病理過程。JAK蛋白包括JAK1、JAK2、Tyk2及JAK3四個家族成員，前三者普遍分布于人體內的各組織中，而JAK3主要在造血細胞及腫瘤細胞中有表達。STAT是機體內非常獨特的蛋白家族，包括STATl-4、STAT5a-b及STAT6七個成員，它們活化后均能與核內DNA結合發揮相應的生物學作用，但每個成員都有自己特定的激活物質及應答方式［17］。白血病抑制因子、血小板生成素和IL-2、IL-6等炎癥因子與各自相應受體結合后能激活JAK激酶，JAK酪氨酸磷酸化位點與STAT5結合，使得STAT5蛋白發生磷酸化，激活的STAT5以同源或異源二聚體的形式入胞核，結合在目的基因啟動子區域的特定序列上，誘導目的基因的表達，從而發揮信號轉導和轉錄調控作用［18-20］，促使Th2細胞的增殖、分化和招募，促進IL-4、IL-6、IL-10等Th2細胞因子的產生，導致濕疹的發生。近年研究發現，SOCS3家族參與了JAK1/STAT5信號轉導的調控，且被認為是該信號通路反饋抑制物［21］。SOCS-3是一類新型細胞因子信號傳導抑制分子，且在健康人的細胞內SOCS-3表達水平極少，幾乎測不出來。然而多種細胞因子可通過JAK1/STAT5信號通路誘導SOCS3基因在15～30 min內迅速轉錄，其表達產物又反過來特異性地抑制JAK1/STAT5信號通路。因此，細胞內SOCS-3蛋白表達量的增加可反映JAK1/STAT5信號通路活性受抑制的程度。

濕疹，壯醫稱之為“能嫩能唅”，屬于典型的“濕毒病”范疇。該病多因飲食不節，損傷脾胃（谷道），運化失健，聚濕生痰阻肺，濕久困于體內化熱，造成體內濕熱蘊積，釀成內毒。加之廣西壯族自治區地處亞熱帶，氣溫常年偏高，降水亦偏多，故廣西地區居民體質易呈陽盛陰盛質，通常體內有熱毒濕毒蘊結。若又兼受外邪，內毒與體內氣血相搏結，加重“谷道、氣道、水道”三道損傷，傷及營衛，邪毒充斥于腠理之中，浸淫肌膚，而發為濕疹。如病情綿延不愈，歷時日久，長久攻擊“三道”，長期損耗龍路（血液系統）內的陰血，導致三道兩路系統功能的異常，陰虧血少而化燥生風，風氣搏于肌膚，使皮損反復遷延。壯醫病因學認為“毒虛致百病”“濕毒”為CE發病和綿延的關鍵要素，“血虛”是CE發病、加重和綿延的先決條件，故以“補血熄風”貫徹治療的始末，以“祛濕解毒”為治療的重點。壯醫臍環穴針刺法具有明顯的“補血調氣”“熄風通絡”“解毒祛濕”的功效。該法以針刺主穴壯醫臍環穴及針刺配穴壯醫肘關穴、膝關穴、外水穴、趾背穴、內龍穴等腧穴，產生的作用經龍路、火路（傳感之道）的轉導，使得人體三道兩路系統暢通、功能恢復，使濕邪從三道排除體外，同時通過激發和增強該系統的自動調節能力，調氣補血糾正氣血失調狀態；另外，該法還可增強人體營衛之氣，推動周天氣血運行，血行而風自滅，且加速邪毒化解，使得“天、地、人”三氣恢復同步，則濕疹自除。

本研究結果顯示，CE血虛風燥證患者PBMC中SOCS3、JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量和血清IL-4、IL-6、IL-10水平高于正常組，表明JAK1/STAT5信號通路活化，促使Th2細胞功能亢進，導致Th1/Th2細胞功能失衡，分泌大量炎癥因子，同時誘導SOCS3蛋白的表達，共同參與CE血虛風燥證的發生發展。觀察組采用壯醫臍環穴針刺法治療后，PBMC中JAK1、pJAK1、STAT5、pSTAT5蛋白表達量與血清IL-4、IL-6、IL-10水平明顯低于西藥組，PBMC中SOCS3蛋白表達量明顯高于西藥組，表明壯醫臍環穴針刺法通過促進SOCS3蛋白過表達來負反饋調節JAK1/STAT5信號通路，從而抑制促炎癥因子釋放，恢復Th1/Th2平衡狀態，消除炎癥的效應機制，達到治療慢性濕疹的目的。兩組臨床療效及EASI、VAS評分比較，觀察組均優于對照組，表明壯醫臍環穴針刺法治療慢性濕疹有較好療效。

綜上所述，壯醫臍環穴針刺法能改善慢性濕疹血虛風燥證患者的臨床癥狀，提高臨床療效，其機理與通過調控細胞內SCOS3-JAK1/SATA5信號通路表達，抑制患者的炎癥反應有關。