脊髓康對大鼠脊髓損傷后膠質瘢痕形成及硫酸軟骨素蛋白多糖表達的影響*

張素，邵陽，華臻，楊俊鋒，王建偉，△

1 南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023；2 南京中醫藥大學無錫附屬醫院

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）多由外傷引起，常導致受損平面以下的運動、感覺、反射及括約肌功能障礙，是造成截癱的主要原因，近年來，隨著現代社會交通、工業的不斷發展，其發病率正呈現逐年增高趨勢，但目前卻仍然缺乏較為理想的治療藥物［1］。因此，尋找療效顯著、安全可靠的治療SCI的方法是當今基礎和臨床研究的熱點之一。脊髓康是王建偉教授以“腎督同治”理論為指導、結合多年臨床實踐創制的經驗方，具有“祛瘀通督，溫腎利濕，調和氣血”之功效。前期研究［2-3］證實，脊髓康能明顯改善脊髓受損區域微環境、促進軸突再生及神經細胞修復，但脊髓康能否對SCI后膠質瘢痕形成產生影響尚不清楚。硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG）是膠質瘢痕中存在的重要抑制分子，其高表達可制約受損區域神經組織修復再生。為此，本研究擬通過觀察脊髓康對SCI模型大鼠脊髓組織受損區域膠質瘢痕形成及CSPG表達的影響，進一步探討脊髓康治療SCI的潛在機制，為臨床治療SCI提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇60只SD大鼠，SPF級，體質量（200±20）g，由無錫市血吸蟲病防治研究所提供，實驗動物合格證號：SYXK（蘇）2017-0050。飼養條件：按5只/籠飼養于無錫市血吸蟲病防治研究所動物房，自由進食、進水，恒溫恒濕。本實驗已獲南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，大鼠在本實驗室經1周適應性飼養后方可開始實驗。

1.2 實驗藥物脊髓康藥液（藥物組成：生黃芪30 g，當歸12 g，川芎10 g，丹參20 g，地鱉蟲10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，制大黃10 g等）為王建偉教授臨床經驗方（國家發明專利ZL200910026193.7），其中生藥由南京中醫藥大學附屬醫院提供，制成質量濃度為1.25 g/mL的水煎劑，4℃保存。0.3%強的松藥液：取300 mg強的松片（意大利輝瑞公司，國藥準字H20110064，規格：100 mg/片）研磨成粉，充分溶解于100 mL生理鹽水中，4℃保存。

1.3 試劑及儀器PBS（北京solarbio公司，批號：20170517）；多聚甲醛（天津市光復精細化工研究所，批號：20180204）；硫酸軟骨素蛋白多糖4（NG2）一抗（英國Abcam公司，批號：BK-K3443）。自制改良Allen’s脊髓損傷造模裝置（南京中醫藥大學骨傷研究所）；4853型冰凍包埋劑OCT（美國SAKURA公司）；CM3050S型冰凍切片機/切片刀（德國leica公司）；BX46型光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；DM500型生物顯微鏡（德國Leica公司）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備以7%水合氯醛腹腔注射麻醉（劑量為0.3～0.4 mL/100 g），將大鼠俯臥位固定于手術臺上，以T10棘突為中心取背部后正中縱行切口，長約3 cm，逐層進入，沿棘突剝離椎旁肌，顯露T9～T11棘突及椎板，仔細咬除T9～T11全部椎板至椎弓根部，暴露硬脊膜并保持其完整性。采用改良Allen法25 g/cm（10 g×2.5 cm）垂直打擊大鼠T9～T11節段脊髓，大鼠后肢痙攣性抽搐數次后軟癱為造模成功。逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚。術后3天每天予以青霉素8萬單位腹腔注射以預防感染，每天2次局部按摩輔助膀胱排尿。

1.4.2 分組及處理將60只SD大鼠稱重后隨機分為4組：正常對照組、模型組、脊髓康組、激素組，每組15只。除正常對照組，其余3組大鼠均進行造模，造模成功后，分別以等體積的生理鹽水、12.5 g/（kg·d）的脊髓康溶液及0.06 g/（kg·d）的強的松溶液灌胃給藥，共給藥14天。

1.4.3 標本制備按照實驗分組，每組分別于干預后3、7、14天隨機抽取3例樣本，脊髓神經功能評定后以體積分數7%水合氯醛生理鹽水溶液麻醉，固定，打開胸腔，經左心室進針至升主動脈，剪開右心耳，PBS快速灌注至流出液體清亮，40 g/L多聚甲醛灌注固定。沿原手術切口暴露椎管，咬除上下節段椎板，輕柔取出脊髓組織，以損傷節段為中心，保留約2 cm長脊髓組織，投入4%多聚甲醛液內繼續固定24 h，石蠟包埋，在距脊髓直接損傷處5 mm部位連續進行厚約4～5μm的超薄切片，每個樣本10張，用于脊髓組織形態學觀察及熒光定量PCR實驗。

1.5 觀察指標

1.5.1 脊髓組織形態學觀察每組隨機抽取6例切片標本，分別予HE染色及EnVision法染色，生物學顯微鏡觀察脊髓的病理形態學改變。其中HE染色標本以受損區域星形膠質細胞反應性改變為觀察重點，關注膠質瘢痕形成情況；EnVision法染色標本以受損區域CSPG蛋白表達情況為觀察重點，以胞漿內淡黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達。

1.5.2 PCR法檢測大鼠脊髓損傷區CSPG表達的檢測每組隨機抽取3例切片標本，PCR法檢測大鼠脊髓損傷后CSPG表達，由生工生物工程（上海）公司進行引物設計并合成，行PCR擴增（正反向分別進行）：CSPG4，5'-GTCCTCCTGCTCCTGGCTCTC－3'和5'-ACAGTTGTGAGTGGAATGGCTTGG－3'，再按照qRT-PCR反應體系加樣、操作，按兩步法進行PCR反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，上述變性、退火步驟循環40次，隨后繼續進行建立熔解曲線的反應：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。反應結束后自動得出擴增曲線和熔解曲線。以管家基因GAPHD作為內參基因，采用2-△△Ct法分析CSPG在脊髓組織中的相對表達量。

1.6 統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析，定量資料以±s表示，采用單因素方差分析及LSD法兩兩比較，不滿足方差分析條件時采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠脊髓組織形態學干預后3天，模型組相對于正常對照組脊髓組織損傷區域內星形膠質細胞反應性肥大和增生明顯，胞漿中的CSPG蛋白染色加深，膠質瘢痕逐漸形成，并且保持到14天；激素組與脊髓康組脊髓組織損傷區域內僅有部分星形膠質細胞亦出現反應性肥大和增生，但星形膠質細胞反應性改變及CSPG蛋白染色加深明顯弱于模型組，膠質瘢痕形成不明顯。見圖1—2。

圖1 各組大鼠脊髓組織形態學表現（HE，×200）

2.2 大鼠CSPG蛋白表達相對水平模型組脊髓組織損傷區域CSPG表達持續增強，并持續至14天。與模型組比較，脊髓康組大鼠CSPG表達于第3、7、14天呈逐步降低趨勢（P＜0.05）；第3天與第14天組內比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。但與激素組相比，脊髓康組大鼠干預后第3、7、14天后的CSPG表達均較高，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖2 各組大鼠脊髓組織形態學表現（EnVision，×200）

表1 各組大鼠脊髓損傷區內CSPG蛋白表達相對水平比較（±s）

表1 各組大鼠脊髓損傷區內CSPG蛋白表達相對水平比較（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與激素組比較，P＜0.05

時間點正常對照組模型組脊髓康組激素組樣本量（個）3 3 3 3 3 d 1 8.40±0.85 4.70±0.95*#1.93+0.15*7 d 1 8.60±0.44 3.50±0.30*#1.87±0.31*14 d 1 9.30±0.50 2.90±0.56*#1.73±0.15*

3 討論

SCI后，脊髓內神經傳導通路遭到破壞，損傷部位周圍的星形膠質細胞反應性活化增生，同時內源性神經干細胞增殖分化成星形膠質細胞并遷移到損傷處，共同參與膠質瘢痕形成［4］。膠質瘢痕可界定損傷區域和神經組織，阻止異常軸突生長，避免繼發性病理損害，具有一定保護作用，但過多形成的膠質瘢痕不僅對神經元再生及軸突延伸形成機械性屏障，還可產生抑制因子，影響神經細胞存活和軸突生長，是阻礙SCI后神經功能恢復的重要原因［5］。

CSPG是目前研究較多的一類抑制因子，來源主要有星形膠質細胞、血源性巨噬細胞、少突膠質前體細胞和腦脊膜細胞，而以后兩種細胞尤為重要，其成分為一組共價結合硫酸葡聚糖鏈的蛋白質，在神經系統內有廣泛分布，大多存在于細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中。一般認為，CSPG在調節細胞與細胞、細胞與ECM相互作用方面起重要作用，對中樞神經系統的發育和成熟、病損的病理和生理反應具有重要意義。正常情況下，CSPG在正常脊髓組織中僅少量表達，常聚集于神經元樹突周圍，起到穩定突觸、抑制不必要可塑性的作用。SCI后，由于原始的星形膠質細胞反應性活化增生，成為反應型星形膠質細胞，進而形成瘢痕形成型星形膠質細胞，膠質瘢痕大量生成，CSPG表達亦隨之逐漸增高。既往研究指出，高表達的CSPG可限制軸突再生、少突膠質細胞遷移和脫髓鞘病變軸突的再髓鞘化［6］。隨著研究的深入，近期一些實驗又為CSPG可抑制小膠質細胞動員和調控的免疫應答提供新的證據［7］，說明CSPG在繼發性脊髓組織病理損害中所發揮的作用還有待更進一步、更全面的認識。

脊髓康是江蘇省名中醫王建偉教授的經驗方。該方由補陽還五湯、小承氣湯等經典方化裁而來，方中重用黃芪補脾胃以資氣血之源，氣旺血行，瘀去絡通；當歸養血和營，使陰生陽長，血旺氣生，有祛瘀不傷血之妙；川芎行氣活血止痛；丹參、赤芍、澤瀉、制大黃等活血化瘀、理氣止痛、通絡復髓、利尿通便。諸藥合用，共奏祛瘀通督、補益肝腎、調和氣血之效。現代藥理學研究［8-10］顯示，黃芪、芍藥、大黃等多種藥物單體或提取物被證實可有效干預SCI繼發性病變，能夠顯著減輕脊髓組織病理損害、促進神經功能恢復。而脊髓康作為中藥復方，與藥物單體或提取物相比，多靶點、多途徑、多層次等治療優勢更加明顯，在發揮作用時整體性更佳，用于治療SCI、促進脊髓功能恢復、改善預后的前景十分廣闊。

綜上所述，減少膠質瘢痕的過度形成及抑制CSPG的高表達是促進脊髓組織損傷的修復和功能重建的重要治療理念之一。本研究結果表明：SCI后，模型組脊髓組織損傷區域膠質瘢痕大量形成，并伴隨CSPG表達持續增強，此過程可持續至第14天。與模型組相比，脊髓康組大鼠脊髓組織損傷區域膠質瘢痕形成受到明顯抑制，同時CSPG表達于第3、7、14天皆明顯降低，并且CSPG表達呈逐步降低趨勢。與激素組相比，脊髓康組膠質瘢痕形成情況差異不明顯，而干預后第3、7、14天CSPG表達均明顯高于激素組。同時隨著干預時間的推移，兩組之間的差距似乎呈縮小趨勢，說明脊髓康能夠顯著抑制SCI模型大鼠脊髓損傷區域CSPG蛋白的表達，但其抑制作用與強的松相較還有一定差距。至于脊髓康是否能起到與強的松相近的抑制CSPG蛋白表達的作用，還需要更多的實驗樣本以及更長時間的治療周期去驗證。

本研究初步證實了中藥脊髓康對大鼠脊髓損傷區域膠質瘢痕形成及CSPG表達具有顯著抑制作用，這可能是脊髓康參與改善局部微環境、促進軸突再生及神經細胞修復的重要機制之一，對進一步明確SCI的病理演變有著積極意義，同時也為藥物研發與臨床治療提供了參考思路。