壯藥青風藤總生物堿對類風濕性關節炎模型大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達的影響*

曹知勇，張青槐，龐宇舟△

1 廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200；2 湖北民族大學醫學部

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床高發的自身免疫性疾病，主要侵犯人體滑膜關節，發病過程復雜，和多種血細胞相關。其中，與血小板關系最為密切。血清P-選擇素（Pselectin，CD62P）是一種選擇素黏附分子，在血小板靜止期，它幾乎沒有表達。但在血小板被炎性介質刺激而活化之后，它被暴露于膜表面，又能脫落至血液中，在細胞內外都產生高表達。而P-選擇素又能促進中性粒細胞和淋巴細胞等白細胞浸潤骨膜關節，導致骨膜異常增生［1］。這樣不斷惡性循環，導致RA病情逐漸加重。血小板內皮細胞黏附因子（platelet endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM-1）是一種免疫球蛋白超家族黏附分子［2］。RA炎性表達高的時候，PECAM-1表達也會隨之升高，引導中性粒細胞和淋巴細胞做趨化運動，加強炎性介質的浸潤滲透。青風藤很早便被運用于RA的治療，并且療效顯著［3-4］。本研究就青風藤生物堿治療RA進行分子層面的探討，觀察壯藥青風藤對RA模型大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠40只，8～10周齡，雄性，體質量200±20 g，購自湖南斯萊克景達，實驗動物合格證號：SCXK（湘）2016-002。飼養條件：室溫由空調控制在23±2℃，相對濕度55%～68%，高壓墊料，每周更換兩次。標準維持鼠料，自由飲用凈化水。適應性喂養7天后開始用于實驗。實驗經廣西中醫藥大學倫理委員會審批，符合動物實驗要求。

1.2 藥物及儀器青風藤干燥藤莖，產地廣西，購于廣西中醫藥大學第一附屬醫院，經鑒定為防己科植物青藤藤莖。天然牛Ⅱ型膠原蛋白、完全弗氏佐劑（Chondrex公司，批號200262）；P-選擇素ELISA試劑盒、PECAM-1ELISA試劑盒（南寧市鵬碧實驗室器材經營部，批號：20171107，20171109）。Direct-Q5uv型超純水系統［密理博（中國）有限公司］；單道可調移液器、MiniSpir型迷你離心機、5810R型高速臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；BD23型小型精密恒溫箱（德國BINDER公司）；AR224CN電子分析天平［奧豪斯儀（上海）有限公司］；XW-80A型漩渦震蕩器（海南市其林貝爾儀器制造有限公司）；DW86290型低溫保存箱（澳柯瑪股份有限公司）；Infinite M200 pro多功能微孔板檢測儀（瑞士帝肯貿易有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備將40只SD大鼠稱重后，隨機分為空白組8只以及造模組32只。將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原蛋白先于4℃低溫保存過夜，第二天與完全弗氏佐劑以等體積乳化。乳化成功后，對造模組大鼠背部及尾部多點行皮下注射，誘導形成RA模型，每只大鼠0.15 mL，7天后進行第二次注射，方法與第一次注射方法相同。空白組大鼠則注射等量的0.9%氯化鈉溶液［5］。采用關節腫脹評分對造模大鼠進行評分，分值范圍為0～16分。造模第21天進行關節評分，評分＞4分即認定為造模成功。

1.3.2 分組及給藥成模大鼠隨機分為模型組和青藤堿低、中、高劑量組，每組8只。青藤堿各劑量組分別給予青藤堿混懸液灌胃，濃度依次為：5、10、20 mg/（kg·d）；模型組與空白組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液；灌胃劑量10 mg/（kg·d），每日1次，持續28天。

1.3.3 標本采集造模成功后，即進行第一輪眼眶取血，離心保存血清。第二次取血于實驗結束后禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，取出后，靜置2 h，以離心半徑10 cm，3000 r/min離心10 min，用移液槍吸取血清保存于-80℃冰箱，用于實驗檢測。

1.4 觀察指標采用ELISA法測定各組大鼠血清中P-選擇素、PECAM-1水平，操作方法嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5 統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件統計。計量資料以±s表示，采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達與空白組比較，造模組大鼠關節腫脹明顯，血清中P-選擇素、PECAM-1水平明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 大鼠造模后P-選擇素、PECAM-1表達（±s）pg/mL

表1 大鼠造模后P-選擇素、PECAM-1表達（±s）pg/mL

注：#表示與空白組相比，P＜0.05

組別空白組造模組鼠數8 32 P-選擇素21.46±2.62 24.35±0.89 PECAM-1 38.57±4.35#39.13±2.71#

2.2 給藥后大鼠血清P-選擇素、PECAM-1表達與模型組比較，壯藥青風藤各劑量組大鼠血清中P-選擇素、PECAM-1表達均明顯降低（P＜0.05），且壯藥青風藤高劑量組明顯低于壯藥青風藤低劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠P-選擇素、PECAM-1水平比較（±s）pg/mL

表2 各組大鼠P-選擇素、PECAM-1水平比較（±s）pg/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05，△表示與青風藤低劑量組比較，P＜0.05

組別空白組模型組青風藤高劑量組青風藤中劑量組青風藤低劑量組鼠數8 8 8 8 8 P-選擇素21.47±3.12*37.93±2.17 24.86±2.79*△28.83±1.78*31.68±2.39*PECAM-1 24.34±1.13*38.56±1.81 28.67±2.23*△29.78±1.84*32.15±2.64*

3 討論

RA是一種病因不甚明確的自身免疫性疾病，在RA發病過程中，多項血常規指標高于正常水平。中性粒細胞、淋巴細胞、血小板體積寬度以及平均血小板體積等都發生異常變化。研究發現，RA發病過程中，血小板過度活化［6］。而P-選擇素和血小板內皮細胞黏附因子表達的增多就是血小板異常活化的產物。楊曉燕等［7］發現血漿P-選擇素的測定有助于RA的早期診斷以及病情監測。謝則金等［8］實驗進一步發現RA病情活動時，會伴隨有血小板的活化，而P-選擇素的高表達可作為血小板異常活化的標志。PECAM-1是調節白細胞滲出和血管通透性的結構基礎，它的表達隨著血小板的變化而變化，參與并維持了血管的完整性［9］。在炎癥初期，PECAM-1有助于白細胞的識別和結合，當受炎性因子持續刺激后，內皮細胞連接部位的PECAM-1減少。這樣一來，血管通透性增強，促進了大量的的血漿蛋白滲出，從而加強體液免疫。TNF-α、IL-1等類風濕炎性因子能改變內皮細胞PECAM-1的分布，從而參與白細胞血管滲出和通透性調節。血清P-選擇素和PECAM-1的表達增加都能促進血小板活性增加，而血小板的活性增加又能夠導致二者的高表達［10］。

青風藤中，青藤堿是青風藤中含量最為豐富的化合物［11］，具有鎮痛，抗炎的功效。臨床使用中發現，青藤堿能有效緩解關節炎癥并抑制骨破壞，尤其是針對RA過程中的破骨細胞（osteoclast cell，OC）。青藤堿能夠抑制OC有關的信號通路，從而抑制破骨細胞對骨質的損傷［12］。吉金雨［13］總結發現青藤堿可通過降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17的水平從而抑制OC分化，防止RA骨破壞。青藤堿抗炎效果明顯，臨床使用廣泛，不良反應較少，且并無耐藥性［14］。

本實驗研究發現，青風藤總生物堿能有效消除關節腫脹，緩解RA的炎性癥狀。而青風藤總生物堿組組間比較發現，高劑量組的效果最好，最能降低血清P-選擇素和PECAM-1的水平。可見，使用青風藤總生物堿治療RA，也需要達到一定劑量才能起到治療作用。本實驗證實了青風藤堿能有效治療RA，可能是通過降低RA模型大鼠血清中P-選擇素和PECAM-1的表達來實現的。