吳鍵 柳華 張云茜 羅麗華 楊志秀 尚正良 劉姚 隆昱洲

(1.云南大學附屬醫院·云南省第二人民醫院·云南省眼科醫院神經外科，云南 昆明 650021；2.成都市第三人民醫院神經內科，四川 成都 610014；3.云南大學附屬醫院·云南省第二人民醫院·云南省眼科醫院神經內科，云南 昆明 650021)

腦卒中是一種常見的具有高致殘率和高死亡率的疾病，其中主要為缺血性腦卒中(Ischemic stroke,IS)，其發生率和死亡率分別為0.247%和0.115%[1]。在我國，IS發生后1年內，病死率高達11.4%～15.4%[2]。目前，治療缺血性腦卒中安全有效的方法是3 h內使用重組人組織型纖溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)進行溶栓治療[3]。然而，受限于極窄的溶栓時間窗，在我國僅有2.4%的患者進行了有效的溶栓治療，遠低于美國的25.1%[4]。腦缺血損傷后，產生大量的氧化自由基，進一步導致神經元凋亡、腦水腫、腦梗死。研究表明，依達拉奉作為一種氧化自由基清除劑，在缺血性腦卒中能夠抑制氧化自由基導致的損傷，發揮神經元保護作用[3-4]。此外，在創傷性腦外傷模型中發現，依達拉奉能夠降低氧化自由基水平并減少損傷體積[5]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是細胞內源性氧化應激和炎癥調節因子，在缺血性疾病中發揮重要作用。研究表明，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)通過ROS敏感的TXNIP激活NLRP3(NLR Family Pyrin Domain Containing 3)炎癥小體[6-7]。NLRP3/ASC/caspase-1信號通路激活后，細胞合成并釋放IL-1β， IL-18導致神經元和膠質細胞凋亡和焦亡[8-9]。因此，本研究認為依達拉奉可通過ROS/TXNIP/NLRP3信號通路降低缺血性腦卒中神經元的損傷。本研究通過體外培養的SD大鼠皮質神經元來研究依達拉奉對缺氧神經元的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康出生24 h內新生SD大鼠16只，購自昆明醫科大學實驗動物中心。所有動物護理和實驗均按照中華人民共和國實驗動物護理和使用科學技術委員會進行，所有動物實驗經云南大學附屬醫院倫理委員會批準通過(2019043)。主要試劑: 依達拉奉、PBS購自sigma；Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式凋亡檢測試劑盒購自同仁化學研究所；NeuN抗體購自 Abcam公司，NLRP3(Bioss,1∶1000)、ASC(Bioss,1∶1000)、TXNIP(Abcam,1∶1000)、caspase-1(Bioss,1∶1000)、IL-18(Bioss,1∶1000)、IL-1β(Bioss,1∶1000)一抗抗體購自KPL公司。電泳儀及電泳槽(E-C Apparatus Corporation，美國)；全波長酶標儀、Western blot 轉膜儀、Cytation5 熒光成像系統和 Gel Doc 凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)；流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠離體皮質神經元的培養 新生SD大鼠用75%酒精浸泡消毒皮膚后，迅速斷頭取腦。剝離出整個腦組織放入有10 mL解剖液(DMEM/F12基礎培養基+1%雙抗)的培養皿中，體式顯微鏡下找到腦膜，剝離腦膜，用顯微剪輕輕剪下大腦皮層組織，放入盛有解剖液的培養皿內，轉移至超凈工作臺內。用顯微剪將取下來的大腦皮層組織在解剖液內剪成約1 mm3大小，用巴氏吸管將組織塊連同解剖液轉移至15 mL離心管內，1000 rpm離心3 min，棄上清，0.25%胰酶消化10 min，巴氏吸管輕輕吹打成單細胞懸液，計數后種植于細胞培養板中。每兩天換液一次。

1.2.2 培養神經元的鑒定 分離培養原代神經元接種至放有包被細胞爬片的24孔板中培養，5天后取出細胞，2%多聚甲醛固定細胞30 min，0.01 M PBS漂洗3次。加入5%羊血清室溫封閉60 min，加入按1∶200稀釋的NeuN一抗，4℃冰箱過夜。第二天取出細胞復溫至室溫，加0.01 M PBST漂洗4次，加熒光二抗于樣本上進行標記，37℃避光孵育1h后以0.01 M PBST漂洗3次。最后滴加50 μL的抗淬滅封片劑(含DAPI)封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3 糖氧剝奪細胞模型的構建 分離培養大鼠皮質神經元并將培養的大鼠神經元隨機分為4組，分別是：①大腦皮層神經元正常培養。②大腦皮層神經元+糖氧剝奪2 h+復糖氧12 h。③大腦皮層神經元+500 μM依達拉奉。④大腦皮層神經元+500 μM依達拉奉+糖氧剝奪2 h+復糖氧12 h。其中缺氧條件為3%O2、5%CO2，復氧條件為20.9%O2、5%CO2。

1.2.4 CCK-8檢測 原代分離神經元，接種至96孔板內，每孔接種5000個細胞，每組3孔重復，接種5 d后構建糖氧剝奪細胞模型，另取3孔未接種細胞的空白孔加入100 μL無糖基礎培養基作為空白組。作用完后每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養箱內孵育2 h后酶標儀450 nm波長下檢測吸光度。細胞活力%=(實驗孔OD-空白孔OD)/(正常細胞孔OD-空白孔OD)×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測 細胞凋亡檢測原代分離神經元細胞接種至6孔板內，每孔接種105個細胞，每組3孔重復，接種5 d后構建糖氧剝奪細胞模型。作用完后0.25%胰酶消化收集細胞，PBS洗3次，100 μL流式凋亡結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC染色液和5 μL PI染色液后混勻，室溫避光孵育15 min后用PBS將液面補至1 mL。用流式細胞儀分析計算神經元細胞凋亡率。

1.2.6 酶聯免疫吸附測定(ELISA) 檢測神經元ROS 取50 μL神經元培養上清加入96空板中；除空白孔外，每孔加酶標試劑100 μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃孵育1 h。棄去孔內液體，甩干，每孔加350 μL洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15 min。依次每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白孔調零，在反應終止15分鐘內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。使用ELISA calc軟件根據神經元細胞濃度和OD值做出標準曲線并計算回歸方程，根據所得回歸方程即可算出樣本中ROS的含量。

1.2.7 Western blot實驗檢測 ROS/TXNIP/NLRP3信號通路相關蛋白的表達水平將培養并進行相應干預的細胞置于裂解液中裂解 30 min，冰上勻漿后 12000×g 離心10 min，獲取上清液，利用 BCA 蛋白質定量試劑盒檢測蛋白的濃度。取 50 μg 蛋白，煮沸變性后上樣，依次進行SDS-PAGE分離、轉膜、封閉，分別加入稀釋的NLRP3(Bioss,1∶1000)、ASC(Bioss,1∶1000)、TXNIP(Abcam,1∶1000)、caspase-1(Bioss,1∶1000)、IL-18(Bioss,1∶1000)、IL-1β(Bioss,1∶1000)一抗抗體，4℃孵育過夜;以TBST清洗 5 min，清洗3次; 加入HRP標記羊抗兔IgG (H+L) 二抗室溫孵育60 min;以TBST 清洗5 min，清洗3次; 避光ECL顯色，凝膠成像系統進行拍照。采用ImageJ 5.0軟件分析圖像灰度值。

2 結果

2.1 成功培養SD大鼠離體皮質神經元 神經元培養后24 h開始長出小的突起，培養5天，突起較為明顯，具有明顯的神經元形態(見圖1A)。經免疫熒光染色后發現，培養的神經元表達神經元特異性標志物NeuN(見圖1B)，表明我們成功培養了SD大鼠離體皮質神經元。見圖1。

圖1 培養的SD大鼠皮質神經元Figure 1 Cortical neurons of SD rat注：A.培養5天SD大鼠皮質神經元形態；B.培養SD大鼠皮質神經元表達神經元特異性標志物NeuN；C.DAPI染培養神經元細胞核；D.B～C圖片疊加

2.2 依達拉奉對皮質神經元細胞活性的影響 按實驗分組處理皮質神經元細胞，并通過CCK-8檢測不同時間點細胞活性變化結果，與正常神經元組相比，糖氧剝奪后神經元細胞增殖活力顯著降低(P<0.001)，依達拉奉處理后明顯提高糖氧剝奪組神經元活力，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 依達拉奉對皮質神經元活力及凋亡率的影響Figure 2 Cultured cortical neurons of SD rats注：A.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元活力的影響；B.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元凋亡率的影響。①P<0.01，②P<0.001

2.3 各組細胞凋亡率 正常神經元組、糖氧剝奪組、依達拉奉處理組、糖氧剝奪+依達拉奉處理組細胞凋亡率分別為(0.877±0.112)%、(32.103±6.221)%、(1.537±0.631)%和(15.673±3.242)%。結果顯示在缺糖缺氧狀態下神經元細胞凋亡率明顯升高(P<0.001)，與糖氧剝奪組相比，經依達拉奉處理后，神經元的凋亡率明顯降低(P<0.001)，凋亡得到明顯改善。

2.4 依達拉奉對皮質神經元細胞ROS水平的影響 按實驗分組以ELISA試劑盒檢測神經元培養上清ROS含量，結果表明糖氧剝奪后神經元ROS水平顯著上升，依達拉奉處理后神經元產生ROS含量又顯著下降(見圖3B)。表明依達拉奉能夠降低糖氧剝奪情況下皮質神經元ROS的產生。

2.5 依達拉奉對ROS/TXNIP/NLRP3信號通路的影響 培養神經元以Western blot 檢測細胞內 ROS/TXNIP/NLRP3信號通路相關蛋白表達。結果顯示，神經元缺氧后IL-1β蛋白(圖3C)、TXNIP蛋白(圖3D)、IL-18蛋白(圖3E)、Caspase-1蛋白(圖3F)、ASC蛋白(圖3G)和NLRP3蛋白(圖3H)表達水平均顯著上升，但在進行依達拉奉處理后又顯著下降(P<0.01)。

圖3 依達拉奉對皮質神經元的影響Figure 3 Effects of edaravone on cortical neurons注：A.依達拉奉處理前后不同處理組皮質神經元免疫印跡實驗；B.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元ROS水平的影響；C.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元IL-1β蛋白表達的影響；D.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元TXNIP蛋白表達的影響；E.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元IL-18蛋白表達的影響；F.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元caspase-1蛋白表達的影響；G.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元ASC蛋白表達的影響；H.糖氧剝奪前后依達拉奉處理對皮質神經元NLRP3蛋白表達的影響。①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001

3 討論

多數臨床研究證實，氧化應激及炎癥反應是介導缺血性腦損傷的兩大病理生理機制，抑制缺血后的氧化應激及炎癥反應可能是治療缺血性腦損傷的重要靶點[10]。已有研究表明，依達拉奉可以顯著減少梗死體積并緩解神經功能缺損，并通過減少氧化應激和炎癥發揮神經元保護作用[11-14]。本研究結果顯示，糖氧剝奪后神經元活力顯著降低，凋亡率顯著上升，經依達拉奉處理后，神經元的凋亡情況得到明顯改善。說明依達拉奉對神經元糖氧剝奪損傷的具有神經保護作用，與以往的研究結論一致。另外，目前研究認為依達拉奉通過減少ROS、脂質過氧化和VEGF水平誘導內皮細胞增殖[15]，并且通過抑制氧化應激反應來發揮作用[16]。在本研究中，缺氧損傷后，神經元氧化應激水平顯著上升，依達拉奉處理后神經元氧化應激水平又顯著降低，也說明了依達拉奉對神經元氧化應激反應的抑制，與上述研究結果一致。

R0S/TXNIP/NLRP3 信號通路作為氧化應激和炎癥反應的重要信號通路之一，參與了多種疾病的發生發展[17-18]，但R0S/TXNIP/NLRP3 信號通路在腦缺血/再灌注性腦損傷中的研究較少。腦缺血時氧化呼吸鏈受損產生的活性氧自由基(ROS)可以通過硫氧還蛋白互動性蛋白(TXNIP)相互之間解離并結合于Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)，進而激活NLRP3[19]。NLRP3炎癥小體由NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β、II-18構成，NLRP3/ASC/Caspase-1級聯通路激活后，促進IL-1β、IL-18的合成和釋放并造成腦組織發生炎癥損傷[20-21]，介導腦缺血神經元和神經膠質細胞的凋亡和“焦亡”。本研究中采用依達拉奉后處理大鼠糖氧剝奪損神經元，我們檢測了各組神經元細胞中NLRP3、ACS、TXNIP、Caspase-1、IL-8和IL-1β蛋白的表達變化情況。結果顯示ROS含量及 TXN1P 、NLRP3 、 ASC和 caspase-1 蛋白水平顯著降低，且血清炎癥因子及腦組織氧化應激指標也顯著變化，因此我們認為依達拉奉能夠降低大鼠糖氧剝奪損神經元中R0S 的含量，抑制TNXIP/NLRP3 等炎性小體相關蛋白的聚集及激活，抑制下游氧化應激指標及炎癥因子的釋放，從而抑制組織細胞的凋亡，減輕腦組織損傷，提高腦缺血耐受，從而降低神經元損傷。

4 小結

依達拉奉后處理能夠抑制ROS/TXNIP/NLRP3信號通路，有效減輕大鼠糖氧剝奪損神經元損傷，這可能是依達拉奉發揮腦神經保護作用的機制之一。也為臨床治療缺血性腦梗死提供了一定的參考。