利拉魯肽對(duì)糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化模型中骨保護(hù)素的影響及機(jī)制研究

楊曉曉 王峰 羅善順 石立力

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院干部一病房，黑龍江 哈爾濱 150001)

最新研究顯示，2021年全球20～79歲人群的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率約為10.5%，預(yù)計(jì)到2045年將上升至12.2%[1]，DM心血管疾病的發(fā)生也呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)[2]，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是DM患者壽命縮短和生活質(zhì)量變差的重要原因[3]。AS具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，血脂異常、血糖高、炎癥和氧化應(yīng)激增加導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷起著重要作用[4]。證據(jù)表明高血糖可以通過不同機(jī)制導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，在血糖濃度較高的情況下，醛糖還原酶等酶可以影響滲透壓和內(nèi)環(huán)境，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行破壞[5]。炎癥是2型糖尿病AS內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵特征，炎癥分子包括腫瘤壞死因子-α、白介素-1β和白介素-6[6]已被證明可以預(yù)測(cè)心血管風(fēng)險(xiǎn)[7]。此外，一氧化氮和硫化氫等氣體遞質(zhì)分子的作用也是導(dǎo)致DM合并AS內(nèi)皮功能障礙的重要原因[8]。氧化應(yīng)激對(duì)DM合并AS的發(fā)生發(fā)展同樣有重要作用，氧自由基可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和遷移。并且加速VSMCs的凋亡，從而進(jìn)一步導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和破裂[9]。VSMCs的增殖、遷移[10]、凋亡[11]和鈣化[12]，對(duì)于AS斑塊的形成至關(guān)重要。

骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)也稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員11B，由血管系統(tǒng)中的VSMCs和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，其釋放可以被促炎細(xì)胞因子(包括白介素-1β和腫瘤壞死因子-α)調(diào)節(jié)[13]。OPG在對(duì)AS的作用中扮演著一分為二的角色。部分體外和動(dòng)物模型的研究表明，OPG具有抑制血管鈣化的作用[14]，目前越來越多的數(shù)據(jù)表明OPG參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的調(diào)節(jié)和AS過程的啟動(dòng)[15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DM合并AS顯著增加骨組織和血清中的OPG水平[16]。給予大鼠注射相當(dāng)于DM患者血清濃度水平重組人OPG，大鼠VSMCs的增殖率顯著增加，表明OPG可能參與了AS的發(fā)病[17]。體外研究[18]表明，OPG在AS斑塊中有所表達(dá)，并且這種表達(dá)與動(dòng)脈VSMCs、內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞的共同調(diào)節(jié)有關(guān)。OPG與DM合并AS的具體關(guān)系及相關(guān)機(jī)制，目前尚無定論，有待進(jìn)一步探索研究。

以利拉魯肽(liraglutide，LIRA)為代表的胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonists，GLP-1 RAs)以其穩(wěn)定的降血糖作用、較低的低血糖風(fēng)險(xiǎn)和額外的心臟保護(hù)作用在降血糖藥中占據(jù)重要地位[19]。多項(xiàng)研究證實(shí)LIRA具有重要的心血管保護(hù)作用[20-21]，并且這種心血管保護(hù)作用是通過延緩AS的發(fā)生和發(fā)展來實(shí)現(xiàn)的[22]，但LIRA對(duì)心血管保護(hù)作用的具體機(jī)制目前仍未完全明確。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)LIRA對(duì)DM合并AS下VSMCs中OPG的影響及相應(yīng)的信號(hào)通路的研究，以探討LIRA抗DM合并AS的可能機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 VSMCs的原代培養(yǎng)及分組

取SD大鼠胸主動(dòng)脈，體外原代培養(yǎng)VSMCs。具體方法如下，5～8周雄性SD大鼠，分離取出整個(gè)胸主動(dòng)脈。將主動(dòng)脈置于培養(yǎng)皿中，剪開血管，剝離血管外膜并且清洗數(shù)次，把血管剪成1 mm2的組織塊，放在加入2 mL胎牛血清T25的瓶中浸泡30 min。把組織塊置于含15%PBS細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶底部，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)細(xì)胞至密度為90%時(shí)，PBS清洗，去上清液，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，并加入細(xì)胞培養(yǎng)液，收集細(xì)胞混合液于15 mL試管，800 r/min離心3 min。吸棄上清液，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。VSMCs生長(zhǎng)2～3 d可傳代一次。

選擇P4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。給予VSMCs不同條件干預(yù)，包括對(duì)照組(5 mmol/L葡萄糖)；高糖組(HG組)(25 mmol/L葡萄糖)；LIRA組(100 nmol/L LIRA)；HG+LIRA組(高糖+LIRA，100 nmol/L)：培養(yǎng)液中先加入100 nmol/L LIRA，后加入高糖；HG+胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)拮抗劑組(高糖+PD98059，50 μmol/L)：培養(yǎng)基中先加入ERK1/2拮抗劑PD98059 50 μmol/L預(yù)處理1 h后加入高糖；HG+ERK1/2拮抗劑+LIRA組(高糖+LIRA+PD98059，50 μmol/L)：培養(yǎng)基中先加入ERK1/2 拮抗劑PD98059 50 μmol/L預(yù)處理1 h后加入高糖及100 nmol/L LIRA；HG+GLP-1受體拮抗劑+LIRA組[高糖+Exe(9-39)+LIRA，200 nmol/L]：在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入高糖及100 nmol/L LIRA前，先加入Exe(9-39) 200 nmol/L作用30 min。

1.2 動(dòng)物模型的制備及分組

取7周的清潔級(jí)雄性SD大鼠120只，體重約200 g，每籠4只，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組(Control組)，LIRA組，DM合并AS組(DM+AS組)，DM+AS+LIRA組，每組30只，對(duì)照組及LIRA組給予普通飼料喂養(yǎng)，DM+AS組及DM+AS+LIRA組給予高脂飼料喂養(yǎng)。1個(gè)月后，DM+AS組和DM+AS+LIRA組給予鏈脲佐菌素(35 mg/kg，溶于預(yù)冷的0.01 mol/L、pH 4.4的檸檬酸鈉緩沖液中)一次性腹腔注射，誘導(dǎo)DM。對(duì)照組及LIRA組大鼠給予等劑量檸檬酸鈉緩沖液注射，注射后7、14 d剪尾取血測(cè)血糖，血糖>16.7 mmol/L為2型糖尿病建模成功。若血糖不達(dá)標(biāo)，再次補(bǔ)給鏈脲佐菌素20 mg/kg，至造模成功。DM造模成功后，四組大鼠仍以前述飼料喂養(yǎng)，其中LIRA兩組給予LIRA 200 μg/kg、2次/d皮下注射，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。于DM成模后0、4個(gè)月分別處死部分大鼠，取胸主動(dòng)脈內(nèi)側(cè)緣行進(jìn)一步相關(guān)檢測(cè)。

1.3 Western Blot法檢測(cè)VSMCs及胸主動(dòng)脈中的OPG蛋白表達(dá)

預(yù)先將 RIPA裂解緩沖液(細(xì)胞部分使用NP-40裂解液)(碧云天)融化，進(jìn)行分裝，并加入1%的苯甲基磺酰氟(碧云天)。在組織樣本中加入 RIPA裂解緩沖液(NP-40裂解液)，置于冰上，并制成組織勻漿液。冷凍離心機(jī)(湖南湘儀) 離心10 min。使用二辛可酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。在十二烷基硫酸鈉緩沖液中降解蛋白質(zhì)，組裝電泳裝置，然后使用電泳在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳凝膠上分離。之后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。用5%脫脂奶粉制成一抗工作液，與一抗OPG (1:200)在4 ℃下過夜。隨后與辣根過氧化物酶(碧云天)偶聯(lián)的二抗IgG(山羊抗兔，1:5 000)(碧云天)在室溫下孵育45 min。在TBS-T(含有0.05%Tween-20)緩沖系統(tǒng)封閉液中洗滌膜后，通過增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(七海生物)底物化學(xué)發(fā)光。隨后抗體剝脫，封閉，孵育內(nèi)參抗體，孵育二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法底物發(fā)光。將膠片掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro analyzer軟件)分析條帶的光密度。

1.4 免疫組化法檢測(cè)胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中OPG蛋白表達(dá)

將組織樣品包埋切片、脫蠟，將切片架置于抗原修復(fù)液中，慢火加熱10 min，自然冷卻，置入PBS(雙螺旋)中重復(fù)3次浸泡5 min。使用3% H2O2(國(guó)藥)室溫孵育15 min， PBS中浸泡5 min，此過程重復(fù)3次。使用山羊血清(Solarbio)封閉。自然冷卻后與抗體OPG (1:200)在4 ℃下孵育過夜。之后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗IgG(山羊抗兔，1:400)繼續(xù)在37 ℃下孵育1 h。將二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑A和B等劑量混合。取出切片，滴加100 μL顯色劑，于顏色變深時(shí)迅速置于水中以終止反應(yīng)。將切片浸沒于蘇木素(Solarbio)中3 min，流水緩慢沖洗2 min。取出切片架，浸入1%鹽酸乙醇中3 s，在流水中反藍(lán)20 min。脫水、透明、封片，鏡檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式表達(dá)。所有數(shù)據(jù)的處理使用SPSS 26.0進(jìn)行。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 LIRA通過ERK1/2及GLP-1受體信號(hào)通路抑制高糖狀態(tài)下VSMCs中OPG的表達(dá)

通過Western Blot檢測(cè)VSMCs中OPG的表達(dá)。與對(duì)照組比較，HG組OPG表達(dá)顯著增加(HG vs Control，*P<0.01)；高糖的基礎(chǔ)上，給予LIRA干預(yù)后，OPG的表達(dá)降低(HG+LIRA vs HG，#P<0.01)；在高糖基礎(chǔ)上，給予ERK1/2拮抗劑(PD98059)，OPG表達(dá)水平下降(HG+PD98059 vs HG，#P<0.01)。在HG+LIRA的基礎(chǔ)上，給予ERK1/2拮抗劑(PD98059)，OPG的表達(dá)相較于HG+LIRA組進(jìn)一步下降(HG+LIRA+PD98059 vs HG+LIRA，+P<0.01)；而在HG+LIRA基礎(chǔ)上，給予GLP-1受體拮抗劑[Exe(9-39)]，可抑制LIRA對(duì)高糖狀態(tài)下VSMCs中OPG的作用(HG+ Exe(9-39)+LIRA vs HG+LIRA，+P<0.01)，見圖1。表明LIRA抑制高糖狀態(tài)下VSMCs中OPG的表達(dá)，并且這種作用與ERK1/2信號(hào)通路以及GLP-1受體信號(hào)通路密切相關(guān)。

注:(A)采用 Western Blot法檢測(cè)不同條件干預(yù)后VSMCs中OPG的表達(dá)水平;“+”表示該組別使用左側(cè)干預(yù)條件,“-”表示該組別未使用左側(cè)干預(yù)條件;(B)不同條件干預(yù)后VSMCs中OPG蛋白灰度分析。圖1 采用 Western Blot法不同條件干預(yù)后VSMCs中OPG的表達(dá)水平分析

2.2 LIRA抑制DM合并AS模型中OPG的表達(dá)

通過Western Blot進(jìn)行OPG表達(dá)水平的檢測(cè)。DM成模0個(gè)月時(shí)，各組OPG表達(dá)均無差異。4個(gè)月時(shí)，與對(duì)照組比較，DM+AS組胸主動(dòng)脈OPG表達(dá)顯著升高(DM+AS vs Control，*P<0.05)。與DM+AS組比較，DM+AS+LIRA組胸主動(dòng)脈OPG表達(dá)降低(DM+AS+LIRA vs DM+AS，#P<0.05)。此外，在DM+AS組，與0個(gè)月比較，4個(gè)月時(shí)胸主動(dòng)脈OPG表達(dá)水平升高(DM+AS-4 vs DM+AS-0，+P<0.05)，見圖2。通過免疫組化進(jìn)行OPG表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果顯示，DM成模4個(gè)月時(shí)，與對(duì)照組比較，DM+AS組胸主動(dòng)脈OPG表達(dá)顯著升高(DM+AS vs Control，*P<0.01)。與DM+AS組比較，DM+AS+LIRA組，胸主動(dòng)脈OPG表達(dá)降低(DM+AS+LIRA vs DM+AS，#P<0.01)。此外，在DM+AS組，與0個(gè)月比較，4個(gè)月時(shí)胸主動(dòng)脈OPG表達(dá)水平升高(DM+AS-4 vs DM+AS-0，+P<0.01)，見圖3。

注:(A)采用免疫組化法檢測(cè)0、4個(gè)月DM合并AS模型中OPG的表達(dá)水平;(B)不同條件干預(yù)后大鼠胸主動(dòng)脈組織0個(gè)月OPG蛋白光密度分析;(C)不同條件干預(yù)后大鼠胸主動(dòng)脈組織4個(gè)月OPG蛋白光密度分析;(D)0、4個(gè)月不同實(shí)驗(yàn)組大鼠胸主動(dòng)脈組織中OPG蛋白光密度分析。圖3 LIRA抑制DM合并AS模型中OPG的表達(dá)(免疫組化法)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，高糖狀態(tài)下以及DM合并AS模型的VSMCs中OPG表達(dá)顯著增高，LIRA可以抑制DM合并AS模型中VSMCs中OPG的表達(dá)增高。

DM合并AS的發(fā)病呈逐年升高趨勢(shì)[2]。高糖狀態(tài)對(duì)AS的預(yù)后存在負(fù)面影響[23]。OPG參與了AS的發(fā)生和發(fā)展[24]。OPG基因敲除小鼠AS發(fā)生的概率升高，說明OPG是保護(hù)血管免受AS影響的重要因素[25]。其機(jī)制可能與RANK-RANKL-OPG信號(hào)軸調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成進(jìn)而抑制血管鈣化的作用相關(guān)[26]。但另有研究[27]結(jié)果表明高糖可促進(jìn)VSMCs中OPG表達(dá)。DM小鼠的主動(dòng)脈和血液循環(huán)中OPG也顯著增加[28]。人群研究[29]表明，血液中OPG的濃度與冠心病的發(fā)生及嚴(yán)重程度之間存在正相關(guān)，OPG是急性冠狀動(dòng)脈綜合征心血管不良事件的發(fā)生及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。之前有研究表明OPG濃度升高可能與血管壁對(duì)各種干擾因素的反應(yīng)有關(guān)。OPG具有增強(qiáng)白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮表面的黏附，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促炎和促纖維化的作用，在AS形成的早期可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖狀態(tài)可以促進(jìn)DM合并AS的發(fā)生和發(fā)展，并且高糖可以促進(jìn)OPG的表達(dá)水平升高。這與以往的研究結(jié)果類似，考慮高糖引起OPG升高的機(jī)制可能與高糖促進(jìn)ERK1/2信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。ERK1/2是絲裂原激活的蛋白激酶的重要成員[31]，ERK1/2信號(hào)通路與AS的發(fā)生密切相關(guān)，研究證實(shí)抑制ERK1/2信號(hào)通路可減少動(dòng)物模型中的AS，在細(xì)胞和動(dòng)物水平上，ERK1/2抑制劑可減少高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E缺乏小鼠AS的發(fā)生[32]。并且它可能促進(jìn)炎癥的發(fā)生，Hankittichai等[33]和Shi等[34]的研究結(jié)果也顯示ERK可以促進(jìn)炎癥的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，高糖可促進(jìn)OPG表達(dá)水平的升高，在高糖的基礎(chǔ)上給予ERK1/2拮抗劑PD98059，OPG表達(dá)水平下降，這說明OPG在DM合并AS模型的VSMCs中升高可能與ERK1/2信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

LIRA是2型糖尿病合并心血管疾病治療的重要藥物[35]。LIRA與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21聯(lián)合應(yīng)用可以使大鼠的AS斑塊面積減小，其AS斑塊面積減小的原因可能與抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的VSMCs中蛋白激酶B和ERK的磷酸化有關(guān)[36]。有研究[37]指出GLP-1可能作用于骨細(xì)胞，從而增加OPG/RANKL的比率。分別于24、48和72 h給予大鼠100 nmol/L LIRA處理后，進(jìn)行OPG表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果顯示MC3T3-E1細(xì)胞中OPG的表達(dá)增高[38]。多項(xiàng)研究[39-40]顯示GLP-1 RAs通過抗炎機(jī)制影響AS，并且或通過調(diào)節(jié)炎癥及血管重塑而減少內(nèi)皮功能障礙。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，LIRA可以抑制DM合并AS模型中OPG的表達(dá)，這與之前LIRA的抗AS的研究結(jié)果相似，雖然在本研究結(jié)果中LIRA可以導(dǎo)致OPG表達(dá)水平下降，這與之前部分研究結(jié)果存在差異?？紤]差異的原因可能與此類研究較少，研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同及指標(biāo)檢測(cè)方式差異等均有關(guān)系。以往研究結(jié)果顯示，高糖可以導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激，激活ERK信號(hào)通路，從而導(dǎo)致AS的發(fā)生。OPG在AS斑塊中有所表達(dá)，并且參與了AS的發(fā)生和發(fā)展。故本實(shí)驗(yàn)中LIRA對(duì)OPG的影響可能是通過其對(duì)炎癥的抑制作用來實(shí)現(xiàn)的。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)行GLP-1與OPG以及炎癥關(guān)聯(lián)的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)中，給予ERK1/2拮抗劑(PD98059)及GLP-1受體拮抗劑[Exe(9-39)]后，可以影響LIRA對(duì)OPG的表達(dá)作用。并且ERK信號(hào)通路與高糖和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，故考慮LIRA對(duì)DM合并AS及OPG的影響與ERK1/2和GLP-1受體信號(hào)通路密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)外研究證實(shí)，OPG在DM合并AS的模型中水平顯著增加。LIRA可以抑制高糖狀態(tài)下OPG的表達(dá)。并且這種作用可能與ERK1/2信號(hào)通路以及GLP-1受體信號(hào)通路密切相關(guān)，故OPG可作為DM合并AS的預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且為研究LIRA抗AS的作用機(jī)制提供了病理生理學(xué)依據(jù)。