黃芩苷鎂對脂多糖聯合D-氨基半乳糖致急性肝損傷大鼠炎癥因子的影響

白冰，郭亞春，石凱行

（1.承德醫學院基礎醫學院，河北 承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院皮膚科，河北 承德 067000）

肝臟是人體內物質代謝和起生物轉化作用的重要器官，急性肝損傷（acute hepatic injury，AHI）是指由于酒精、病毒、化學藥物等一種或多種因素導致的短時間內肝功能急劇損傷，損傷嚴重還可能導致肝功能衰竭伴有很多并發癥，具有很高的致死率[1]。對于治療肝損傷，目前國內外并沒有合適的藥物，因此尋找在臨床上能夠有效治療肝損傷的藥物成為研究熱點。中藥黃芩性苦寒，具有清熱瀉火、燥濕解毒之效，可以治療黃疸[2]。黃芩主要成分為黃芩苷，具有抗炎、抗氧化等藥理作用。據文獻報道，黃芩苷對非酒精性脂肪性肝炎具有一定的治療作用[3]，還對對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷小鼠具有保護作用[4]。由于水溶性差的特點，致使黃芩苷臨床應用受到限制，而水溶性及穩定性極好的黃芩苷鎂解決了這一問題[5]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯合D-氨基半乳糖（D-Galactosamine，D-GalN）制備急性肝損傷模型是國內外公認的經典方法[6]，其誘導的急性肝損傷病理變化與臨床乙肝病理變化類似[7]，主要是由炎癥介導的免疫性肝損傷。當中毒、感染等內外因素刺激下，免疫調節作用失控，二者比例失衡，活化的免疫細胞分泌大量炎癥因子，就可能會引起免疫功能紊亂，進而造成肝細胞損傷[8]。有報道D-GalN 致急性肝衰竭大鼠模型中存在Th 細胞分泌的炎癥因子失衡[9]，在肝損傷的過程中IL-6、IFN-γ、TNF-α 等Th1 類細胞因子發揮主要作用[8]。因此，本研究擬通過檢測炎癥因子水平來探究黃芩苷鎂尾靜脈給藥對LPS/D-GalN 誘導急性肝損傷大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 54 只SPF 級雄性SD 大鼠購于維通利華，許可證號SCXK（京）2016-0006，5 周齡，重（170±10）g，本研究已通過我校倫理委員會審批，批準文號：CDMULAC-20181219-006。大鼠飼養于SPF級環境。試劑及儀器：LPS、D-GalN（Sigma-Aldrich），異甘草酸鎂（正大天晴藥業），黃芩苷鎂（純度為85%，由承德醫學院劉翠哲教授課題組提供），紅帽負壓液體采集管（不抗凝）國產（Bebolabs），大鼠IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 試劑盒（聯科生物），SIM-F124 制冰機（日本SANYO 公司），PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa），DEPC處理水（DNase、RNase free）（Beyotime），普通RIPA（組織/細胞）裂解液（附PMSF 1.5 ml）（Solarbio），引物（TaKaRa），PCR 儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 大鼠適應性飼養1 周，按照隨機數字表法分為模型組、正常組、黃芩苷鎂（BAMg）高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），異甘草酸鎂組（MgIG）（18 mg/kg），每組9 只。給藥組尾靜脈注射相應濃度的藥物連續7 d，1 次/d，模型及正常組以相同方法給予等量生理鹽水。根據前期實驗結果，確定造模條件為20 μg/kg LPS 聯合400 mg/kg D-GalN，于12 h 后取材[8]。

1.2.2 ELISA 法檢測血清炎癥因子 取材，大鼠血液離心后得到血清置于冰上備用；在標準品孔中，分別加入呈比例稀釋的標準品100 μl 作為標準曲線，加100 μl 標準品稀釋液于空白孔內作為空白對照，在樣本孔中，加入樣本溶液20 μl、1×檢測緩沖液80 μl；然后所有孔加入稀釋好的檢測抗體溶液50 μl；37 ℃孵育1.5 h；沖洗6 次；加辣根酶標記的鏈霉親和素100 μl/孔；37 ℃孵育30 min；沖洗6 次；避光加入顯色底物100 μl/孔，避光室溫孵育30 min；加終止液100 μl/孔；30 min 內，上機檢測450 nm 條件下的OD 值；處理數據，檢測血清樣本中IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 24.0 統計軟件分析數據，計量資料采用（±s）表示，使用單因素方差分析LSD 或Games-Howell 進行檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗；設置檢驗水準α=0.05，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

模型組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂高、中劑量組、異甘草酸鎂組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂低劑量組血清IFN-γ 水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂低劑量組血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；黃芩苷鎂中、低劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平高于異甘草酸鎂組，差異有統計學意義（P＜0.05）；黃芩苷鎂高劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平與異甘草酸鎂組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；黃芩苷鎂高、中、低劑量組血清TNF-α水平與異甘草酸鎂組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平比較（±s，pg/ml）

表1 各組血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平比較（±s，pg/ml）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與異甘草酸鎂組比較，cP＜0.05

3 討論

黃芩苷鎂是黃芩苷與鎂離子耦合形成的水溶性化合物，它是黃芩苷在植物中的主要存在形式[10]。有文獻報告黃芩苷在腎損傷、心肌損傷、脊髓損傷、肺損傷等方面均有一定的治療作用[11-14]。課題組前期研究發現BA-Mg 可改善CCl4誘發的大鼠急性肝損傷[15]，其可能通過Nrf2/ARE 信號通路抑制氧化應激反應發揮保護作用[16]。有研究報道了黃芩苷鎂對急性肺損傷小鼠就有一定保護作用[17]。因此本研究通過BA-Mg 預處理大鼠1 周后，進行LPS/D-GalN 誘導急性肝損傷[7]，研究BA-Mg 對LPS/D-GalN 誘導急性肝損傷是否有保護作用。

免疫應答是機體免疫系統識別并清除“非己”物質的整個過程，需要T、B 細胞及多種固有免疫細胞相互協調、共同作用完成[18]。T 細胞來源于骨髓造血干細胞，在胸腺發育成熟后定居在外周淋巴器官中的胸腺依賴區，當受到某些特定的抗原刺激后就會被激活、增殖，并分化為發揮效應的T 細胞和具有記憶作用的T 細胞，通過淋巴細胞再循環周游全身發揮免疫調節和細胞免疫功能[19]。依據T 細胞在免疫應答中的功能，將其分為輔助性T 細胞（Th 細胞）、細胞毒性T 細胞（Tc 細胞）和調節性T 細胞（Treg 細胞）。Th 細胞主要分為Th1、Th2 細胞，其中Th1 細胞活化分泌IL-1、IL-2、IFN-γ、TNF-α 等因子，Th2 細胞活化分泌IL-4、IL-6、IL-10 等因子。正常生理狀態下，Th1/Th2 細胞處于動態平衡，調節機體正常免疫應答，在肝損傷狀態下導致二者比例失衡，促炎因子大量分泌，進而可能會引起免疫功能紊亂[8]。由此，實驗研究檢測了大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 含量。

本研究發現，AHI 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 水平高于正常組（P＜0.05），與文獻報道相一致[20,21]，提示LPS/D-GalN 誘導的AHI 過程中，可能使Th1 細胞過度活化，大量分泌IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ 等因子，進而導致炎癥反應。黃芩苷鎂高、中、低劑量組可以降低LPS 聯合D-GalN 致急性肝損傷大鼠血清中IL-6、IL-1β、IFN-γ的水平，其中以黃芩苷鎂高、中劑量組較為突出（P＜0.05）。黃芩苷鎂高、中、低劑量組血清中TNF-α 水平有下降的趨勢，與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示TNF-α 可能并不是BA-Mg 影響的主要因子。因此，BA-Mg 可能通過抑制Th1 細胞的過度活化，進而抑制分泌促炎因子，發揮抗炎作用。黃芩苷鎂高劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IFN-γ 水平與異甘草酸鎂組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），黃芩苷鎂中、低劑量組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、IFN-γ水平較異甘草酸鎂組高（P＜0.05），提示高濃度BA-Mg 可能與MgIG的抗炎效果一致。

綜上所述，LPS 聯合D-氨基半乳糖可造成急性肝損傷，釋放大量炎癥因子。基于前期AHI 模型建立的條件，黃芩苷鎂可以通過抑制炎癥因子產生來發揮保肝作用，但黃芩苷鎂是否通過影響Th1、Th2細胞增殖來抑制炎癥因子產生，有待進一步研究。