MiR-320c 低表達通過抑制TGF-β/Smad 通路減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞的侵襲及遷移的研究

孫衍，渠海，宋祺，申一凡，王儷娟，牛曉紅

（長治醫學院附屬和濟醫院內分泌科1，普通外科2，山西 長治 046011）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種以持續性蛋白尿和進行性腎功能下降為特征的臨床綜合征[1]。據報道[2]，DN 發生在糖尿病患者中的機率占20%～50%，并且是發生終末期腎臟疾病的常見原因。此外，DN 通常與動脈高血壓和心血管疾病發病率和死亡率的增加有關，嚴重影響患者的生命安全及預后[3，4]。因此，探究治療DN的措施及手段顯得尤為重要。微小RNA（miRNA，miR）是一類非編碼的單鏈小分子RNA[5]。最近，越來越多的證據表明miRNA 與DN的發生和發展密切相關[6，7]。在高糖（high glucose，HG）處理的腎小球系膜細胞中，過表達miR-141 可促進細胞凋亡并加劇炎癥[8]。因此，miRNA 可能成為DN的診斷性生物標志物和治療靶標。最近的一項研究表明，與2 型糖尿病相比，DN 患者中miR-320c的表達升高，這表明miR-320c的過表達可能對DN有害，但其潛在機制尚不清楚[9]。此外，另一項研究表明抑制miR-320c 可通過靶向KIF14 促進nephrin及podocin 表達，抑制HG 誘導的足細胞損傷[10]。基于以上研究結果，本研究以腎小管上皮細胞HK-2為研究對象，探索miR-320c 在HG 誘導的HK-2 細胞中的表達及其對DN 作用的可能分子機制，旨在為DN 診斷及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人腎小管上皮細胞HK-2 購自武漢普諾賽生物生命科技公司；葡萄糖購自美國sigma公司；DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；胰蛋白酶、Lipofectamine2000 購自美國Thermo Fisher 公司；miR-320c inhibitor 及inhibitor NC 由廣州銳博生物科技公司合成；兔抗人的轉化生長因子β1 TGF-β1、p-Smad2/3 抗體購自美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自上海艾博抗公司；Trizol、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；Ace－QqPCR SYBR Green Mix，高敏型ECL 化學發光檢測試劑盒及RIPA 裂解液均購自南京諾唯贊生物公司；6 孔及24 孔細胞板購自美國Bio-Rad 公司；Transwell cell（孔徑8.0 μm）購自美國Corning 公司；Matrigel 膠購自美國BD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組 HK-2 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 完全培養基中，并置于37 ℃，5%CO2恒溫培養箱培養。取生長至對數期的HK-2細胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，按照1×104個/ml，100 μl 每孔的密度接種于6 孔板，正常對照組（control組）：用含有5.5 mmol/L 葡萄糖的培養基培養24 h；高糖組（HG組）：用含有45 mmol/L葡萄糖的培養基培養24 h；HG+inhibitor NC 組：將inhibitor NC 轉染至HK-2 細胞，并用含有45 mmol/L葡萄糖的培養基培養24 h；HG+miR-320c inhibitor組：將miR-320c inhibitor 轉染至HK-2 細胞，并用含有45 mmol/L 葡萄糖的培養基培養24 h。轉染嚴格按照Lipofectamine 2000 試劑說明書進行操作。

1.2.2 qRT-PCR 實驗 取對數生長期的各組細胞，采用Trizol 法裂解細胞，RNA 抽提試劑盒提取細胞的總RNA。立即用逆轉錄試劑盒合成cDNA，qRTPCR 試劑盒進行miR-320c的檢測。反應體系：cDNA 模板（50 ng/μl）1.5 μl，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μl，SYBR Green Mix 6 μl，單蒸水1.3 μl，共10 μl。反應條件：95 ℃，3 min 30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，20 s；共40 個循環。以U6 為內參，2-ΔΔCt法計算定量miR-320c 表達水平。實驗重復3 次。

1.2.3 細胞形態觀察 高糖誘導24 h 后，收集4 組HK-2 細胞，制備細胞涂片，在普通光學顯微鏡下觀察4 組HK-2 細胞的形態并拍照。

1.2.4 Transwell 侵襲實驗 將Matrigel 和4 ℃預冷無血清培養基以1∶8的比例稀釋后，包被在Transwell小室底部聚碳酸酯膜的上室面，將Transwell 小室放入24 孔板中，置于37 ℃培養箱中待Matrigel 凝固。將HK-2 細胞密度調至1×105個/ml，按每室200 μl接種于Transwell 小室上室中，24 孔板加入500 μl含10% FBS的DMEM 培養液培養12 h 待細胞貼壁，按前述分組及處理法處理細胞，在24 孔板中培養24 h 后，取出Transwell 小室，擦去Matrigel 膠和小室內的細胞，用預冷的4%多聚甲醛固定小室外底面的細胞30 min，0.1%結晶紫染色15～20 min，在顯微鏡下隨機選取6 個視野計算穿膜細胞個數，實驗重復3 次，取平均值。

1.2.5 細胞劃痕實驗 取各組處于對數生長期的HK-2 細胞，用含10% FBS的DMEM 培養基調整細胞密度至2×105個/ml，并按2 ml/孔接種于6 孔板，培養至細胞貼壁，并使融合率達90%，用200 μl 移液槍頭在6 孔板內劃線，用顯微鏡分別在0、24 h 對細胞愈合狀態觀察拍照，并用Image J 軟件測量各組細胞劃痕愈合面積，實驗重復3 次，計算平均值。細胞遷移率（%）=[（0 h 劃痕距離-24 h 劃痕距離）/0 h 面積]×100%

1.2.6 Western blot 實驗 收集前述各組細胞，用RIPA裂解液進行裂解。用BCA 法測定其蛋白濃度，裂解液在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。然后，在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，配置TGF-β1 和p-Smad2/3 蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。用PBST 洗膜后用二抗室溫孵育2 h。高敏型ECL 化學發光檢測試劑盒對蛋白條帶進行顯色，并使用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，定量蛋白表達。

1.3 統計學分析 應用SPSS 21.0 統計學軟件分析數據，GraphPad Prism 9 軟件作圖，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著，P＜0.001 表示統計學意義極顯著。

2 結果

2.1 高糖誘導對HK-2 細胞中miR-320c 表達的影響 采用qRT-PCR 法檢測miR-320c 在HG 處理的HK-2 細胞中的表達特征。結果顯示，與control 組比較，HG 組中miR-320c 水平明顯升高（P＜0.001）。此外，與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中miR-320c的表達顯著降低（P＜0.01），見表1、圖1。

圖1 高糖誘導對HK-2 細胞中miR-320c 表達的影響

表1 高糖誘導對HK-2 細胞中miR-320c 表達的影響（n=3，±s）

表1 高糖誘導對HK-2 細胞中miR-320c 表達的影響（n=3，±s）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，##P＜0.01

2.2 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞形態變化的影響 control 組中，HK-2 細胞呈鵝卵石樣立方體形狀，排列緊密，為典型的上皮細胞形態；經HG 處理后，HK-2 細胞變長，與鄰近細胞解離，失去鵝卵石樣形態，呈現紡錘形；而與HG+inhibitor NC組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中紡錘形細胞數量較少。結果表明，抑制miR-320c的表達可使HG誘導的HK-2 細胞形態回歸正常，見圖2。

圖2 抑制miR-320c 對高糖誘導HK-2 細胞形態變化的影響

2.3 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞侵襲能力的影響 與control 組比較，HG 處理HK-2 細胞后，細胞侵襲能力明顯增強，侵襲細胞數明顯增多（P＜0.001）；而與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中細胞侵襲能力顯著降低，侵襲細胞數也明顯減少（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞侵襲能力的影響（n=6，±s）

表2 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞侵襲能力的影響（n=6，±s）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，#P＜0.05

圖3 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞侵襲能力的影響（×200）

2.4 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞遷移能力的影響 與control 組比較，HG 處理HK-2 細胞24 h 后，細胞的遷移能力顯著增強，遷移率明顯提高（P＜0.001）；而與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中細胞遷移能力顯著降低，遷移率也明顯降低（P＜0.001），見圖4、表3。

表3 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞遷移能力的影響（±s，n=6）

表3 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞遷移能力的影響（±s，n=6）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，###P＜0.05

圖4 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞遷移能力的影響（×200）

2.5 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞TGFβ/Smad 通路的影響 與control 組比較，HG 處理HK-2 細胞后，TGF-β1 及p-Smad2/3的表達顯著增強（P＜0.001）；而與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中TGF-β1（P＜0.05）及p-Smad2/3（P＜0.01）的表達顯著降低，見表4、圖5。

表4 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞TGF-β/Smad 通路的影響（n=3，±s）

表4 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞TGF-β/Smad 通路的影響（n=3，±s）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

圖5 抑制miR-320c 對高糖誘導的HK-2 細胞TGF-β/Smad 通路的影響

3 討論

目前，miRNA 作為基因表達關鍵調控因子，在各種疾病發生發展中具有重要影響[11]。據報道[12]，miRNA的失衡與DN的發展密切相關。miR-21 inhibitor 可以抑制DN 中（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）及腎臟纖維化，同時改善腎臟的結構和功能[13，14]。MiR-34a-5p 在HG 誘導的HK-2細胞中上調，其過表達可能通過靶向SIRT1 加重腎小管間質纖維化[15]。研究顯示[16，17]，miR-320c 在DN患者中明顯上調，表明miR-320c 可以作為治療DN的候選靶標。此外，抑制miR-320c 可通過靶向KIF14 促進nephrin 及podocin 表達，抑制HG 誘導的足細胞損傷。本研究旨在闡明miR-320c 在DN 中的調控作用及其分子機制，實驗結果顯示在HG 誘導的HK-2 細胞中，miR-320c的水平明顯高于正常HK-2 細胞，之后還合成了miR-320c inhibitor以探索其功能。細胞形態結果顯示，抑制miR-320c下調miR-320c 表達水平，可以保留HK-2 細胞正常的鵝卵石立方體形狀，這表明miR-320c 可能對DN 有害。

EMT 被認為是腎小管間質纖維化發生發展的起始因素之一[18]。目前，EMT的發生已經在各種形式的慢性腎臟疾病中得到了證實，包括DN[19]。盡管腎小管間質纖維化也可能在這些疾病早期階段出現，但物質的積聚往往伴隨著疾病進展，與腎功能逐漸下降有關[20]。因此，進行性腎小管間質纖維化通常是導致DN 腎衰竭的常見途徑。上皮細胞通過EMT 從上皮間室轉移到間質，獲得完整的間質表型，其特征是上皮細胞間黏附性鈣粘蛋白表達減少，α-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白表達增加[11，21]。這種向間充質狀態的轉變促進了細胞運動并形成了新的膜突起。最后，增加的細胞突起和金屬蛋白酶的表達導致額外的細胞基質降解，細胞遷移和侵襲行為[22，23]。即EMT的發展伴隨著細胞遷移和侵襲能力的增強[24]。在本研究中，Transwell 侵襲試驗和細胞劃痕實驗表明，用HG 處理的HK-2 細胞中侵襲細胞的數目和遷移率顯著增加，但是抑制miR-320c 可以顯著降低這些細胞的侵襲性和遷移能力。這些數據進一步說明了miR-320c inhibitor 可以抑制HG 誘導的HK-2 細胞的侵襲性和遷移能力，從而可能發揮EMT 抑制作用。

TGF-β1 是DN的關鍵中介因子[25]。TGF-β1 通過與TGF-β 受體Ⅱ（TβRⅡ）結合啟動其細胞內信號轉導，激活TGF-β 受體Ⅰ（TβRⅠ）激酶，導致受體調控的Smads 磷酸化，稱為Smad2 和Smad3[26，27]。在DN 患者及1 型DN的實驗動物模型中，通過腎小球和小管間質細胞中磷酸化的Smad2 和Smad3的核易位，TGF-β/Smad 信號被高度激活，TGF-β/Smad 信號的激活顯著促進了腎小球和小管間質纖維化[28，29]。在體外，高糖環境、年齡和血管緊張素Ⅱ可以激活Smad2 和Smad3，誘導系膜細胞、小管上皮細胞和血管平滑肌細胞合成膠原基質[30]。因此，TGF-β/Smad 信號通路在DN 中是過度激活且有害的。目前，有一些報道揭露了TGF-β/Smad 信號通路在DN 中的作用。比如，抑制miR-135a-5p 可通過靶向SIRT1 改善DN 中誘導的腎纖維化[31]；miR-346通過TGF-β/Smad 信號通路調控DN 相關基因表達,在DN的發生和發展中起到非常重要的作用[32]；芪地糖腎顆粒通過TGF-β1-Smad2/3 通路下調TGF-β1的表達水平從而對DN的纖維化產生治療作用[33]。在本研究中，結果發現HG 處理HK-2細胞后，TGF-β/Smad 信號通路被高度激活，而加入miR-320c inhibitor 可抑制HG 誘導下HK-2 細胞TGF-β/Smad 通路的激活，表明抑制miR-320c的表達可通過抑制TGF-β/Smad 信號通路對DN產生治療作用。

綜上所述，本研究證明了與正常HK-2 細胞相比，HG 處理的HK-2 細胞中miR-320c 顯著上調。此外，抑制miR-320c的表達可以抑制HG 誘導的HK-2 細胞的侵襲和遷移，從而可能對EMT的發生起作用。最后，miR-320c 抑制劑對TGF-β/Smad 信號通路的表達具有負調控作用。