MicroRNA-744 調控PRKACA 和FGF2 對皮膚燒傷愈后瘢痕形成的影響

燒傷（burn）是導致皮膚損傷的主要原因之一，根據世界衛生組織統計

，全世界每年有近30 萬人死于燒傷。在嚴重燒傷過程中，細胞和血管均受到損傷，分子代謝出現異常調控，進一步導致各種非編碼RNA 和細胞因子等分子調控出現紊亂

。有研究表明

，微小RNA（microRNA）參與了皮膚燒傷后的分子調控代謝過程，其中microRNA-744 在皮膚燒傷具有重要調控作用。蛋白激酶cAMP 激活催化亞基α（PRKACA）是參與細胞信號轉導的重要分子之一

。成纖維細胞生長因子（FGF）是組織穩態和癌癥中的關鍵有絲分裂原，FGF2 在皮膚燒傷愈后的分子機制中也具有重要作用

。本研究主要探討microRNA-744 調控PRKACA 和FGF2 對皮膚燒傷愈后疤痕形成的影響和分子間的相關性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和動物 30 只健康新西蘭大白兔由騰新生物技術有限公司提供（許可證號：SCX2021-0004），體重2.0～2.5 kg，雌雄各半。清潔級動物室適應性飼養1 周，在制備燒傷動物模型前24 h 禁食不禁水，實驗方案獲佳木斯大學附屬第一醫院倫理委員會審批通過。microRNA 提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；qRT-PCR 檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；microRNA 檢測引物U6（北京天根生化科技有限公司）；microRNA檢測引物miR-744（天根生化科技有限公司）；RNase-Free 雙蒸水（北京天根生化科技有限公司）等。

1.2 實驗儀器 實時熒光定量PCR（美國應用生物系統公司）、瓊脂糖凝膠電泳儀(美國Bio-Rad 公司)、反轉錄PCR（美國應用生物系統公司）、-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo Scientific 公司）、蛋白凝膠成像儀（美國Wealtec 公司）、超凈工作臺（山東新華醫療器械股份有限公司）、4 ℃低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）等。

1.3 方法

1.3.1 燒傷模型和組織樣本收集 提前24 h 由耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉，麻醉后行頸內靜脈和頸動脈穿刺置管備用，將兔背部涂抹10%硫代鈉脫毛，燒傷面積為總體表面積的30%。體表面積公式：A（m

）=R×W2/3，A 為體表面積（m

），W 為體重（kg），經計算燒傷面積約為514 cm

。根據燒傷時間和常用燒傷動物模型制作方法進行分組，分別為對照組、燒傷組、愈后組，每組10 例。組織樣本離體后迅速冷凍至液氮中，直至MicroRNA 提取。

1.3.4 ELISA 實驗檢測PRKACA 和FGF2 每孔加入100 μl 標準品、空白樣品或樣品；棄掉每個孔的液體，然后不要洗，向每孔加入100 μl 檢測試劑A 工作溶液；用微量加樣槍吸出每個孔并洗滌，重復3次，總共洗滌3 次；每孔加入100 μl Detection Reagent B 作溶液，蓋上一個新的密封板，在37 ℃孵育1 h；重復抽吸/洗滌5 次；每孔加入90 μl 底物溶液，蓋上新的Plate 密封劑，在37 ℃下孵育15～30 min，避光；每孔加入50 μl 終止液，如果顏色變化不均勻，輕輕敲打板確保充分混合；確定每個孔的光密度到450 nm，使用酶標儀一次測定；根據酶標儀的標準曲線進行數據分析。

從圖1可以看出，一對一類型占有對應要素的一半以上，由此可見在共同表達的要素中，大部分要素是存在映射關系的，這也是軍民基礎地理信息分類代碼標準融合的一個基礎。

2.2 各組PRKACA 和FGF2 表達量比較 燒傷組和愈后組PRKACA 表達水平低于對照組，且愈后組低于燒傷組，差異有統計學意義（

＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 表達水平高于對照組，且愈后組高于燒傷組，差異有統計學意義（

＜0.05），見表1。

1.3.2 血液樣本收集 用不含抗凝劑的試管釆集外周靜脈血0.5 ml，室溫下3000 r/min 離心15 min，去除血細胞，收集上層血清，然后將收集血清在4 ℃，3000 r/min 離心15 min，進一步除去殘留血細胞；小心吸取上層血清至新的離心管，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

2.1 各組microRNA-744 表達比較 燒傷組和愈后組microRNA-744表達量分別為（6.901±1.031）、（7.583±1.067），均高于對照組的（4.671±1.012），差異有統計學意義（

＜0.05）。

1.3.5 Western Blot 檢測組織PRKACA 和FGF2 蛋白表達 組織加入裂解液，4 ℃裂解1 h 后，12 000 g，4 ℃離心30 min，取上清，放于-80 ℃冰箱中，每次電泳之前進行蛋白測定，使用蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，然后進行一抗、二抗反應，最后再進行顯色反應和凝膠圖象分析。

2 結果

針對不同的需求可以選擇各種優化方法。余剛珍[1]、何雨松[2]結合ANSYS結構拓撲優化技術，優化了各自零件性能并將零件減重；劉基岡[3]等人基于有限元進行了液壓機的結構優化設計，優化結果設計的液壓機結構最大應力減小23%,剛強度性能滿足設計要求；詹威[4]、張東生[5]、潘鋒[6]等結合模態分析對各自零件進行優化設計，最大限度地減輕了共振頻率對產品運行的影響。由于連桿架本身尺寸不大，而且其端面上存在支撐板，拓撲優化已不適用，因此選取尺寸參數優化。通過簡化建模，結合有限元采用參數化分析，選用 Screening篩選優化方法，最終得到3種優選方案，結合模態分析得到最終方案。

1.3.3 qRT-PCR 檢測MicroRNA-744 表達 首先進行樣本microRNA 提取分離，合成microRNA cDNA第一鏈，再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA（圖1），然后再進行反轉錄實驗，反轉錄程序包括：①RNA加尾反應和反轉錄反應42 ℃，60 min；②酶失活反應95 ℃，3 min。microRNA 熒光定量檢測：按實驗樣本數量計算各試劑總量，分裝到反應管中，然后加入引物和microRNA cDNA，再加入樣本的cDNA，混勻，離心，設置反應程序，進行檢測，然后觀察結果。樣本microRNA 使用核酸定量儀測定RNA 濃度和純度，光密度A260/A280 均在1.8～2.0 間表明RNA無降解。microRNA 經逆轉錄生成cDNA 后，進行瓊脂糖凝膠電泳。運用qRT-PCR 檢測各組樣本時，如果溶解曲線分析未見雜峰，擴增產物單一，表明沒有非特異性擴增。用U6 為內參，反應結束后計算Ct值。根據擴增曲線得到microRNA-744 和U6的Ct值，通過公式計算ΔCt（ΔCt=CtmicroRNA-744-CtU6），運用2

法對各組樣本microRNA的表達水平。

式中，sinφ和cosφ分別對應LP11a模和LP11b模；r、φ分別為模場軸向和角向坐標，ξ可表示為

2.3 各組PRKACA 和FGF2 蛋白表達量比較 燒傷組和愈后組PRKACA 蛋白表達低于對照組，且愈后組低于燒傷組，差異有統計學意義（

＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 蛋白表達高于對照組，且愈后組高于燒傷組，差異有統計學意義（

＜0.05），見圖2、圖3、表2。

2.4 MicroRNA -744 和 PRKACA、FGF2的關系Pearson 相關性分析顯示，microRNA-744 和PRKACA 呈負相關（

=-0.821，

＜0.05），與FGF2 呈正相關（

=0.773，

＜0.05）。

“我們下一步正在推進寬帶鄉村、高清瀘州的工程建設，推進5G商用和IPV6（互聯網協議第6版 ）規模部署，建設高速、移動、安全、泛在的信息基礎設施。同時瀘州市還要深度拓展智慧應用，實施‘互聯網+’行動計劃，推動公益互聯網平臺建設，持續開展‘萬企上云’的活動。”劉春表示。

3 討論

MicroRNA 是參與基因轉錄后調控非常重要的非編碼RNA，且其可間接影響相關蛋白質表達

。目前，已經有很多研究表明

，microRNA 與燒傷的分子調控機制密切相關，大多數microRNA 有抑制相關蛋白質表達的作用，但是microRNA-744 在皮膚燒傷愈后瘢痕形成中的具體分子機制仍尚未明確。

FGF2 是一種多功能蛋白，在傷口愈合、組織修復和再生中具有重要作用。這種治療性蛋白質廣泛用于燒傷治療，因為其可刺激細胞增殖和分化、血管生成和細胞外基質重塑

。本研究結果發現，燒傷組和愈后組microRNA-744 表達量高于對照組（

＜0.05）；燒傷組和愈后組PRKACA 表達水平及蛋白表達低于對照組，且愈后組低于燒傷組（

＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 表達水平及蛋白表達高于對照組，且愈后組高于燒傷組（

＜0.05）；Pearson 相關性分析顯示，microRNA-744 和PRKACA 呈負相關（

＜0.05），與FGF2 呈正相關（

＜0.05），提示microRNA-744 表達可以通過抑制PRKACA 間接促進FGF2的表達，且在燒傷及愈后的發生發展中，microRNA-744的先降低和再升高導致PRKACA、FGF2 表達量發生改變，因此在燒傷及愈后發生發展中，microRNA-744 可以調控PRKACA、FGF2 表達，進而可以作為預測燒傷輕重程度及愈后發展的分子指標。

EPDM彩色顆粒塑膠地面是在按要求鋪設好的石油瀝青路面基層上，涂刷一層單組份聚氨酯膠水，當聚氨酯底涂料逐步滲入瀝青基礎的表面空隙后，即可在表面形成密封狀的薄膜，從而起到防水作用，也使基礎和塑膠面層的粘合力得到增強。

綜上所述，microRNA-744 通過影響PRKACA和FGF2 含量變化，從而從分子水平實現影響調控燒傷及愈后發生發展的作用。

[1] Roshangar L,Soleimani Rad J,Kheirjou R,et al.Skin Burns:Review of Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches[J].Wounds,2019,31(12):308-315.

[2] 梁娜娜,薛喜娟,劉曉慧,等.燒傷患者照顧者生活質量及其影響因素[J].河南醫學研究,2021,30(31):5769-5773.

[3] Barnes LA,Marshall CD,Leavitt T,et al.Mechanical Forces in Cutaneous Wound Healing: Emerging Therapies to Minimize Scar Formation[J].Adv Wound Care (New Rochelle),2018,7(2):47-56.

[4] Savoji H,Godau B,Hassani MS,et al.Skin Tissue Substitutes and Biomaterial Risk Assessment and Testing [J].Front Bioeng Biotechnol,2018,6:86.

[5] Gibson ALF,Carney BC,Cuttle L,et al.Coming to Consensus:What Defines Deep Partial Thickness Burn Injuries in Porcine Models?[J].J Burn Care Res,2021,42(1):98-109.

[6] Zhang M,Li H,Zhang Y,et al.Oncogenic miR-744 promotes prostate cancer growth through direct targeting of LKB1[J].Oncol Lett,2019,17(2):2257-2265.

[7] Kang W,Huang T,Zhou Y,et al.miR-375 is involved in Hippo pathway by targeting YAP1/TEAD4-CTGF axis in gastric carcinogenesis[J].Cell Death Dis,2018,9(2):92.

[8] Moody SE,Schinzel AC,Singh S,et al.PRKACA mediates resistance to HER2-targeted therapy in breast cancer cells and restores anti-apoptotic signaling[J].Oncogene,2015,34(16):2061-2071.

[9] Jimenez-Pascual A,Mitchell K,Siebzehnrubl FA,et al.FGF2:a novel druggable target for glioblastoma?[J].Expert Opin Ther Targets,2020,24(4):311-318.

[10] 胡雅瓊,白俊,陳琳,等.miR-625-5p 通過靶向調控PRKACA 促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲[J].中國癌癥雜志,2021,31(6):447-454.

[11] Yu W,Chen PB,Chen FC,et al.MicroRNA-744 promotes proliferation of osteosarcoma cells by targeting PTEN[J].Mol Med Rep,2020,21(5):2276-2282.

[12] Ahn HN,Kang HS,Park SJ,et al.Safety and efficacy of basic fibroblast growth factors for deep second-degree burn patients[J].Burns,2020,46(8):1857-1866.