榨菜根腫病菌拮抗菌株的分離篩選及促生特性分析

唐愷言,何硯秋,申枚琳,黃 琴,韋宇新，黃 銳,趙 珂

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院微生物學(xué)系，成都 611130)

根腫病自1737年于英國地中海西岸和歐洲南部發(fā)現(xiàn)以來，已對世界各地十字花科作物的生產(chǎn)和發(fā)展帶來了嚴(yán)重影響。隨著我國近年來對十字花科作物栽培數(shù)量和種類的不斷擴大，十字花科植物根腫病的發(fā)生概率和面積也在不斷上升[1-2]。根腫病是由專性寄生菌蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)導(dǎo)致的土傳性病害[3]。根腫病菌可通過昆蟲活動、灌溉水流動、帶病植株等多種方式在十字花科植物中進(jìn)行傳播，其休眠孢子囊可在土壤存活8～15年，病菌極強的傳染性以及孢子超長的存活能力等原因?qū)е赂[病的防治工作非常困難[4]。

對于根腫病的防治技術(shù)，目前主要集中在化學(xué)農(nóng)藥篩選、田間管理、抗病植株培育等方面[5]。化學(xué)藥劑雖然可以一定程度上殺死病原菌，但長期施用易造成土壤環(huán)境污染[6]。此外通過施用生石灰、輪作等田間管理手段也極耗人力、物力，抗病植株的篩選更需要較長時間，且由于病原菌存在生理小種，培育出的抗病植株也無法大規(guī)模耕種[2, 7]。近年來隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入加大，生物防治因其高效、安全、成本低廉等特點在農(nóng)業(yè)病害防治中備受關(guān)注。研究表明植物內(nèi)生枝頂孢屬真菌(Acremoniumalternatum)、枯草芽抱桿菌XF-1(Bacillussubtilis)、放線菌等對根腫病的防治都具有顯著效果[8-11]。芽孢桿菌作為生物防治領(lǐng)域的典型代表可通過競爭、分泌抗菌或溶菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種方法對植物病害進(jìn)行防治。本研究以主要的十字花科作物榨菜為研究對象，采集成都平原主要榨菜種植區(qū)的植株根際土壤，分離榨菜根際土壤中的芽孢桿菌，并篩選具有抗根腫病和促生潛力的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 實驗所用根際土土壤樣品、患病榨菜的根組織、榨菜種子均采集自成都郫縣唐昌鎮(zhèn)柏木村榨菜種植區(qū)。

1.1.2 儀器設(shè)備 采用電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)對樣品進(jìn)行干燥處理；采用全自動蒸汽滅菌鍋(北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；采用光學(xué)顯微鏡(ZEISS公司)進(jìn)行根腫菌休眠孢子活性觀察。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 根際芽孢桿菌分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，分別加入制霉菌素50mg/L；純化保種培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；根腫病菌拮抗菌株初篩培養(yǎng)基。MM-Chitin培養(yǎng)基；根腫病菌拮抗菌株復(fù)篩培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基。

1.2.2 根際芽孢桿菌分離、純化 將采集的根際土樣用80℃高溫預(yù)處理10min后用無菌水稀釋成10-4、10-5、10-6共3個濃度梯度。分別取100μL菌懸液均勻涂布于3種分離培養(yǎng)基，每組重復(fù)3次。涂布后的平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d。對分離出的具有不同形態(tài)的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化，并進(jìn)行革蘭氏染色[12]，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的顏色及顯微形態(tài)，去除非芽孢桿菌的菌株。將鏡檢后的純培養(yǎng)芽孢桿菌菌株用LB斜面試管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 根腫病菌拮抗菌株初篩 菌株初篩以其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的強度作為標(biāo)準(zhǔn)，供試菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的活性檢測方法參照劉翠萍等的方法。

1.2.4 根腫病菌拮抗菌株復(fù)篩 菌株復(fù)篩以其對病原菌休眠孢子囊活性的抑制情況和對病原菌根毛侵染抑制情況進(jìn)行檢測。

1.2.5 菌株促生功能檢測 菌株產(chǎn)IAA能力參考Gordon[13]方法進(jìn)行測定；定性測定菌株產(chǎn)鐵載體能力參照Schwyn和Shin[14-15]的方法進(jìn)行；菌株溶磷能力采用PKO培養(yǎng)基進(jìn)行檢測[16]；菌株降解纖維素能力采用纖維素剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行檢測[17]；菌株產(chǎn)蛋白酶活性采用無脂蛋白酶培養(yǎng)基進(jìn)行檢測[18]；菌株固氮能力采用NFM無氮培養(yǎng)基進(jìn)行檢測[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 根際芽孢桿菌的分離與純化

從根際土壤樣品中共分離獲得110株菌，通過觀察菌株菌落形態(tài)以及顯微鏡特征，如菌株細(xì)胞革蘭氏染色情況、產(chǎn)芽孢情況等，對分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。結(jié)果顯示有86株菌為芽孢桿菌，菌落大多呈乳白色，表明具有褶皺或粗糙，質(zhì)地干燥，少數(shù)菌株具有分泌粘液、色素的特性，顯微鏡下觀察到菌株革蘭氏染色為陽性，且大部分菌體中央有卵圓狀芽孢(圖1)。

圖1 芽孢桿菌形態(tài)

2.2 根腫病菌拮抗菌株初篩

對根際芽孢桿菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性檢測結(jié)果表明，分離出的86株菌株中有18株芽孢桿菌菌落周圍出現(xiàn)了不同大小的透明水解圈，其中菌株A1的水解圈最大，水解圈>15mm，此外菌株A2、A5、A7三株菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力也較強，水解圈>10mm(表1)。

表1 菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性檢測結(jié)果

2.3 根腫病菌拮抗菌株的復(fù)篩

2.3.1 病原菌休眠孢子囊活性的抑制檢測結(jié)果 對篩選的28株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的芽孢桿菌進(jìn)行病原菌休眠孢子囊活性抑制實驗，通過顯微鏡鏡檢失活休眠孢子囊數(shù)，并統(tǒng)計失活率(表2)。經(jīng)沸水浴致死處理后失活率達(dá)86%，對照組失活率為4.80%，實驗組失活率在3.47%～13.56%之間，其中菌株A14、A5、A23、A10、A22、A13這6株菌株對休眠孢子囊的活性抑制率明顯高于對照組，且A14抑制率最高，為13.56%，表明這6株菌具有潛在抑制休眠孢子囊活性的能力。

表2 菌株對休眠孢子囊活性的抑制結(jié)果

2.3.2 病原菌根毛侵染抑制檢測結(jié)果 對篩選的6株具有潛在抑制病原菌休眠孢子囊活性的菌株進(jìn)行根毛侵染抑制實驗，通過對根毛染色觀察分別統(tǒng)計處理7d和14d后的受侵染率(表3)。結(jié)果表明處理7d后實驗組侵染率為14.00%～53.33%，其中菌株A5處理(14.00%)明顯低于對照組(59%)；處理14d后，實驗組侵染率為34.23%～80.00%，菌株A5(42%)、A10(34.23%)兩個處理組明顯低于對照組(87.66%)，表明A5和A10兩株菌對于抑制病原菌侵染根毛具有一定能力。

表3 菌株對根毛侵染的抑制效果

2.4 菌株促生功能檢測結(jié)果

對篩選的6株具有潛在抑制病原菌休眠孢子囊活性的菌株進(jìn)行促生功能檢測(表4)。結(jié)果表明6株菌均可產(chǎn)IAA，其中菌株A5產(chǎn)IAA濃度最高，達(dá)到了13.20mg/L。6株菌中只有A10、A14、A22具有固氮能力，溶磷檢測結(jié)果顯示除A10和A23外，其余4株菌均具有溶磷效果，但溶磷能力并不強，溶磷水解圈均低于5mm。產(chǎn)鐵載體能力檢測結(jié)果顯示除A23外其余5株菌都能產(chǎn)生鐵載體，其中菌株A22水解圈最大。產(chǎn)蛋白酶檢測結(jié)果顯示除A14以外其余菌株均具有產(chǎn)蛋白酶能力，且都大于10mm，說明這些菌株以利用蛋白質(zhì)作為碳源的能力較強。降解纖維素能力檢測結(jié)果顯示，6株菌纖維素降解圈都大于10mm，都有高效降解纖維素能力，6株菌都具有2種及以上的促生功能。

表4 菌株促生功能檢測結(jié)果

3 討論

芽孢桿菌廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中，因具有抗逆性極強的內(nèi)生孢子而具有較強生命力。研究表明芽孢桿菌在代謝過程中會產(chǎn)生多種有機物質(zhì)，不僅能夠抑制病原菌的生長還能對農(nóng)作物的生長起到良好促進(jìn)作用[20]。周京龍等[21]研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌在防治棉花枯萎病的同時對其還具有促生能力。Lahlali等[22]發(fā)現(xiàn)了一株對油菜根腫病具有良好防治效果的枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisQST713)。本研究對分離自榨菜根際土壤的芽孢桿菌進(jìn)行了根腫病病原菌抑菌性實驗以及促生功能分析，結(jié)果表明86株根際芽孢桿菌中僅有18株菌具有產(chǎn)幾丁質(zhì)能力，對18株菌進(jìn)行病原菌休眠孢子囊活性的抑制檢測實驗，發(fā)現(xiàn)僅有6株菌對孢子活性具有明顯抑制效果，且6株菌都具有產(chǎn)IAA和纖維素酶能力，其中A5的IAA產(chǎn)量最高，為13.20mg/L，除固氮能力外，A5其余促生功能指標(biāo)都較好。

休眠孢子囊的萌發(fā)是導(dǎo)致根腫病泛濫的重要原因，通過使休眠孢子囊失活可有效降低根腫病的發(fā)生。將篩選的18株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶根際芽孢桿菌制備成菌液處理榨菜根腫病原菌休眠孢子囊，結(jié)果顯示僅有A5、A10、A13、A14、A22、A23 6組處理的休眠孢子囊失活率明顯高于對照組(4.80%)，具有使休眠孢子失活的潛力，其失活率為9.54%～13.56%。劉翠萍等[23]在對甘藍(lán)根腫病的生防菌篩選結(jié)果中顯示其篩選出的菌株對休眠孢子囊的失活率為14.23%～31.36%，遠(yuǎn)高于本研究的最高失活率，但其對照組失活率(21.84%)也遠(yuǎn)高于本研究的4.80%，這種差異可能與病原菌的植物寄主不同、采樣地區(qū)差異等因素有關(guān)。對6株具有顯著失活效果的菌株進(jìn)行不同時間病原菌根毛侵染抑制實驗，結(jié)果表明隨著處理時間的延長，病原菌根毛的侵染率呈上升趨勢，處理7d后只有菌株A5處理(14.00%)顯著低于對照組(59%)，處理14d后，菌株A5(42%)和A10(34.23%)2個處理組顯著低于對照組(87.66%)，表明A10和A5號菌對于抑制病原菌侵染根毛具有一定能力。這可能是因為相較于其他幾株菌，A10和A5有更高的吸附根系的能力，定值能力強，更大的占領(lǐng)了植物根系表面的生態(tài)位，并產(chǎn)生更豐富的次生代謝物，對病原菌的侵染有更強的抑制效果[24-25]。

根際微生物可通過分泌多種代謝物促進(jìn)植物生長進(jìn)而達(dá)到抑制病害侵襲的，增強植物抗病的作用[26]。本研究對篩選出的6株對根腫病具有防治潛力菌株開展了促生功能檢測，結(jié)果顯示6株菌均具有降解纖維素和產(chǎn)IAA的能力，且纖維素水解圈都大于10mm，除A14外，其余5株菌均具有產(chǎn)蛋白酶能力，除A23外其余5株菌均具有產(chǎn)鐵載體能力，6株菌中分別有4株菌具有溶磷能力和3株菌具有固氮能力。篩選的兩株具有抗根腫病潛力的菌株A10和A5都具備5種促生功能。因此，芽孢桿菌A5和A10在抑制榨菜根腫病，促進(jìn)榨菜生長上具有一定潛力，結(jié)果可為十字花科植物根腫病生防試劑菌株資源的篩選提供科學(xué)參考。

4 結(jié)論

從榨菜根際土壤中共分離出86株根際芽孢桿菌，其中僅有18株菌具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力，對這18株菌進(jìn)行病原菌休眠孢子囊活性的抑制檢測實驗，選出了6株與對照組相比具有顯著抑制效果的菌株，在此基礎(chǔ)上對6株菌病原菌根毛侵染抑制實驗以及菌株促生功能進(jìn)行了探究。綜合比較結(jié)果獲得了具有較好抗菌能力及促生效果的兩株根際芽孢桿菌菌株為A5和A10。