四川南充地區部分豬場呼吸道疫病主要病原調查與分析

王懷禹，劉強，何子雙，龍冬梅，魏玲

（1.南充職業技術學院 四川南充 637131；2.閬中大北農農牧食品有限公司 四川南充 637400）

豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）是一種由多種病毒、細菌、支原體以及環境應激、不良的飼養管理和機體免疫力降低等諸多因素相互作用引起的豬只呼吸道疾病的總稱。在規模化豬場養殖過程中，PRDC 病原主要分為兩大類，即原發性病原與繼發性病原，前者主要包括豬圓環病毒2 型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）等；后者主要包括副豬嗜血桿菌（HPS）、豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）、豬肺炎支原體（MH）、豬鏈球、多殺性巴氏桿菌（Pm）、綠膿桿菌和豬附紅細胞體（eperythrozoonsuis）等。PRDC 感染通常由多種病原混合感染引起，臨床上常見感染途徑為原發性病原先侵入豬只呼吸道和肺臟破壞呼吸道的防御屏障，引起免疫抑制，進而降低感染豬體呼吸道抵抗力，然后豬體內潛在病原或環境外源病原共同引起呼吸道疾病。據已報道的臨床統計，PRRSV 和PCV2 混合感染最為常見，對豬場PRDC的發生起著不容忽視的影響。PRDC 一年四季均可傳播流行，但在秋末、冬春較寒冷季節高發，感染率可達30%～80%，病死率約為10%～30%，主要感染6～10 周齡保育豬和13～20 周齡的育肥豬，且豬齡越小感染率和死亡率越高，不同時期的發病豬臨床癥狀、發病特點有所不同。南充是畜牧大市，2020 年生豬出欄量位居四川省第一，為確保生豬產能恢復，為生豬產業健康發展保駕護航，做好豬疫病防控顯得尤為重要，及時調查分析豬場重要疫病-呼吸道疫病綜合征主要病原混合感染狀況，能夠為有效地防控PRDC 提供科學依據。本研究采集了2020—2021 年南充地區部分規模化豬場及散養戶疑似PRDC 發病豬的肺、腎和淋巴結等組織病料236 份，了解南充地區規模化豬場及散養戶豬只PRDC 主要病原混合感染狀況，基于檢測結果的分析為規模化豬場疫病有效防控提出解決方案。

1 材料

1.1 病料來源

本研究所用樣品來自四川省南充地區9 個縣市，主要采集具有咳嗽、呼吸困難和體溫升高等疑似PRDC 癥狀的發病豬肺、腎和淋巴結等組織病料，2020 和2021 年檢測樣品分別為126 和110份，合計236 份。

1.2 主要試劑

細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（購自北京百泰克生物技術有限公司），RNAiso Plus Total RNA 提取試劑（購自上海生工生物工程股份有限公司），DNA Marker2000、TRIzol、2X Taq Master Mix、瓊脂糖（購自大連寶生物工程有限公司）；無水乙醇、異丙醇、DEPC、氯仿等（購自四川協力生物有限公司）；麥康凱、TSA 及改良Friis 培養基等。

1.3 引物設計與合成

所用引物參考NCBI 相關病原基因組序列，利用Primer 6.0 設計軟件選取保守序列設計各自特異性引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 方法

2.1 調查法

對病料來源的豬場相關管理、技術人員進行問卷和座談等形式的調查，調查內容主要涉及養豬場基本情況、存欄量、免疫情況、疫病流行特點，如臨床癥狀與剖檢病變、各生長階段死淘情況及防治措施和效果等，切實了解疫病發生的情況。

2.2 實驗室檢測法

采集疑似PRDC 臨床癥狀的典型發病豬現場剖檢采樣，無菌采集病豬肺臟、淋巴結、血液等病料組織樣品進行實驗室檢測，本實驗主要對PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、HPS、MH、鏈球菌、產毒性巴氏桿菌共計8 種PRDC 常見病原進行了檢測，各病原所有引物詳見表1。

表1 PRDC 8種常見病原引物

2.2.1 病毒鑒定

1）DNA 和RNA 提取。待檢測樣品分別進行DNA 和RNA 提取。首先對病料進行研磨、離心等處理，再按照DNA 提取試劑盒說明書提取相關DNA，同時使用提取試劑完成RNA 的提取。RNA 提取方法如下：①在200μL 病料懸液中加入1,000μL TRIzol 細胞裂解液，4℃靜置10min 后，12,000r/min 離心10min；②取上清并在其中加入約1/2 體積的氯仿，4℃靜置10min，12,000r/min 離心10min；③取上清加入等體積異丙醇，4℃靜置10min，12,000r/min 離心10min；④去上清后，在離心管中加入75%乙醇1,000μL，反復沖洗沉淀，12,000r/min 離心5min。室溫靜置10min 后，溶于20μL DEPC 水中進行反轉錄。

2）DNA PCR 擴增。將所提取DNA 分別利用特異性引物進行PCR擴增，PCR反應體系為：2X Taq Master Mix 10μL，DNA 0.5μL，上下游引物各0.5μL，補滅菌HO 至總體積20μL。PCR 反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30 個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存。取10μL PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳后，在凝膠成像儀上觀察結果并記錄。

3）RNA RT-PCR。檢測CSFV 和PRRSV 分別采用套氏PCR 和普通RT-PCR。CSFV 套式PCR 擴增第1 輪一步法擴增反應體系為：2× 1 Step Buffer 20μL，Prime Script TM One Step Enzyme Mix 1.5μL，外套上下游引物各1μL，RNA模板1.5μL，用RNase-free Water 補至總體積50μ L；第1 輪擴增條件為：50℃反轉錄30min，94℃預變性5min；95℃變性15s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35 個循環；最后72℃延伸10min；4℃保存；第2 輪擴增反應體系為：Premix Taq Enzyme 25μL，內套上下游引物各1μL，第1輪PCR產物300倍稀釋后為模板1.5μL，用RNase-free Water 補反應體積至50μL。第2 輪擴增條件為：94℃5min；95℃15s，54℃30s，72℃30s，35 個循環；最后72℃延伸10min；4℃保存。普通RT-PCR 擴增程序為：94℃5min；94℃30s，59℃45s，72℃30s，30 個循環；最后72℃延伸10min。取10μL 第2 輪PCR 產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統上照相觀察并記錄結果。

2.2.2 細菌的分離鑒定將病料組織分別接種到麥康凱、含5%牛血清的TSA 培養基和含5%牛血清、0.01%NAD 的特殊培養基中進行細菌分離培養，37℃培養過夜。選取典型疑似病原菌的菌落進行革蘭氏染色鏡檢、擴菌、生化試驗及PCR 鑒定。細菌培養特性、菌落形態及生化鑒定詳見表2。

表2 分離菌培養特性

2.2.3 支原體的分離鑒定將采集的肺組織等病料，加入改良Friis 液體培養基進行無菌研磨制成肺組織乳劑，靜置后，取上清液接種于含50%豬鼻支原體特異性血清的改良Friis 液體培養基中，37℃培養4～10d，每天記錄pH 值變化，且每隔5d 盲傳1 次。取0.2mL 液體培養物接種于改良Friis 固體培養基表面，37℃、5%CO條件下培養，觀察是否有支原體樣菌落。將疑似支原體菌落接種于改良Friis 液體培養基中，37℃培養，每日觀察顏色變化及pH值變化。變黃后進行PCR 鑒定。

3 結果與分析

3.1 調查結果與分析

本實驗采集病料來自南充地區9 個縣市如嘉陵區、閬中市、南部縣、儀隴縣、西充縣、蓬安縣、營山縣等12 個規模化養殖場和8個散養戶。規模化養殖場均采用水泡糞飼養模式，存欄均在1 萬頭以上，散養戶存欄均在1,000 頭以上。20 個豬場疑似PRDC 死淘豬主要集中在30～110 日齡，臨床主要表現為發熱、氣喘、呼吸困難、消瘦、咳嗽、背毛粗亂、眼鼻分泌物增多，有的后肢關節腫脹等。病豬剖檢發現病變均集中在肺部。

3.2 實驗室檢測結果與分析

通過對236 份病料進行PCR 檢測，結果顯示，236 份病料樣品中，236 份均為陽性，檢出率為100%。其中有189 份檢出PCV2，陽性率為80.1%，151 份檢出PRRSV，3 份檢出CSFV，34份檢出PRV，35 份檢測出鏈球菌，22 份檢測出產毒性巴氏桿菌，11 份檢測出豬肺炎支原體，14 份檢測出副豬嗜血桿菌，詳見表3。對陽性組織樣品進行病原學分析時，所有病料既有單一病原感染，也有混合感染，且混合感染非常普遍，236 份陽性樣品中有207 份為混合感染，占所有陽性樣品的87.7%，而且混合感染類型相當復雜，病原分析發現二重感染較為普遍，PCV2 和PRRSV 混合感染率最高為47.5%，其次為PCV2+PRV 感染率為14.4%，有一部分病料為三重甚至四重混合感染情況，三重感染中以PCV2+PRRSV+SS 感染率最高約4.7%，四重混合感染率為0.4%，未發現五重感染（詳見表4）。

表3 病原鑒定結果

表4 混合感染情況

4 小結與防控

PRDC 在世界各地普遍存在，在養豬生產實際中，該病往往由一種或多種病原體感染所致。近年來我國PRDC 持續感染，危害日漸明顯和嚴重，特別是現代化規模化豬場養殖模式下，病原日益復雜，多重感染或混合感染是當前常見的發病規律，常見以病毒性、細菌性、病毒與細菌混合等多種感染形式出現。研究發現潛在的原發性病原主要為病毒類；繼發性感染是導致病豬大量死亡的主要原因。根據臨床分析，PRRSV 和PCV2 是最常見的混合感染，對PRDC 發生有著非常重要的影響。

本次研究采集了236 份南充地區部分豬場病料，主要檢測了8 種常見的PRDC 病原：PRRSV、CSFV、PCV2、PRV、SS、HPS、Pm、MH。結果顯示，雖然各豬場存在的主要呼吸道疾病不同，在毒株、菌株種類及感染情況等方面存在差異，但各豬場普遍存在PCV2和PRRSV 的混合感染和繼發感染，這提示在四川南充地區豬群中普遍存在PRDC，且引起的病原也非常復雜，PRRSV 是造成當地豬場保育和育肥階段豬群呼吸道疾病的重要因素之一，日常關注環境控制和病原混合或繼發感染、控制豬群死淘率是各豬場應重視的問題。在多種病原混合感染過程中，病原間具體的作用機制有待進一步研究。

分析PRDC 在我國普遍流行的原因，有以下幾種：對于保育階段的豬群而言，此階段豬只自身免疫系統、消化和呼吸系統功能尚不健全，且體內母源抗體逐漸降低，加之斷奶、混群等應激因素，導致該階段豬群感染率發病率高。育肥階段的豬群飼養密度過大、通風不良、營養缺乏和免疫機能降低等是導致豬群呼吸道疾病暴發的主要原因。

防控PRDC 的有效方法是科學免疫結合藥物防治，各豬場應結合實際情況進行有針對性防治。PRDC 完整的防治計劃應從以下幾個方面著手：豬場要采取嚴格的生物安全措施，制定合理的免疫接種程序，加強各類疫病的控制和監測，強化豬場日常管理，詳細記錄豬群生長情況、產量記錄等信息，對于重點豬群如保育豬、育肥豬等應盡可能避免各類應激反應，合理控制豬舍飼養密度，堅持營養全面、科學搭配的喂養原則，給予全價的優質飼料，確保飼料中蛋白質、氨基酸和微量元素等營養物質的供應，確保保育舍的保溫和通風等。日常飼養過程中，嚴格執行清潔衛生制度和消殺制度，對于潛在的病原攜帶者如外來人員或車輛、物品等進行風險管控，防止外界病原體的傳入而引發感染。對于一些常見細菌，極易產生耐藥性，因此對于細菌類疾病養豬場應根據藥敏試驗結果選用高效抗菌藥物，并能夠聯合用藥或交替使用異種抗菌類藥物，但要注意藥物間配伍禁忌。

隨著養殖技術的不斷提升和現代集約化養殖模式的擴大，各類豬病本身也發生著新的變化，不僅表現在抗原表位的突變，混合感染的復雜化、耐藥機制的多元化等，多種病原的相互作用，使得機體多系統并發癥日益嚴重，疫病防控越來越難。呼吸系統作為動物機體的對外口戶，更是眾多病原的突破口，因此是預防疾病的重中之重。在當前豬病嚴峻形勢下，有必要加強對豬群的疫病監測和疫苗免疫。