高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定慶陽地產(chǎn)黃酒中環(huán)匹阿尼酸

徐婭茹，錢 慜，陳德陽，孫國政

（1.慶陽市食品檢驗檢測中心 甘肅慶陽 745000；2.慶陽市疾病預防控制中心，甘肅慶陽 745000）

環(huán)匹阿尼酸（Cyclopiazonic Acid，CPA）是由甲羥戊酸、色氨酸和二醋酸酯單元生物合成的吲哚四胺酸，是曲霉屬和青霉屬的幾種真菌次級代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素[1]。黃酒是世界上最古老的酒類之一，是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵酒，歷史悠久，文化綿長。黃酒的產(chǎn)地較廣，品種多樣，釀造原料、發(fā)酵方法以及色澤口感都具有地域特色。因地域文化差異，人們對黃酒的品鑒標準也各有傾向，但這絲毫不影響中國居民對黃酒的喜愛。黃酒既可作為烹飪料酒，也可以作為飲用酒、保健酒等。在甘肅慶陽市，黃酒釀造普及家家戶戶，是逢年過節(jié)餐桌上必不缺少的佳品。但是自家釀黃酒的工藝不同，缺少過程控制，容易造成雜菌污染，并產(chǎn)生一些有害的次級代謝產(chǎn)物。當前，國內(nèi)尚未出臺環(huán)匹阿尼酸檢測標準。鑒于此，本實驗采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對黃酒中環(huán)匹阿尼酸進行檢測，利用質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏度特點，對慶陽地產(chǎn)黃酒品質(zhì)進行初步研究，為食品安全檢測行業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃酒，慶陽本地產(chǎn)，38 批次；環(huán)匹阿尼酸（Pribolab公司）；內(nèi)標：U-Cyclopiazonic Acid（U-CPA）（Pribolab公司）；甲醇（色譜純）；屈臣氏飲用水（蒸餾熟水制法）。

1260+G6460C 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；超聲波清洗儀，德國密理博公司；0.22 μm水相過濾膜、有機相過濾膜，上海安普實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

環(huán)匹阿尼酸提取：準確吸取黃酒樣品5 mL，加入U-CPA10ng，用5 mL 甲醇作提取液，振搖提取120 min，混合離心（4 000 r·min-1）5 min，用微孔過濾膜（0.22 μm）過濾后進樣。

1.2.2 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm×3.5 μm）； 流 動 相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇（色譜純）；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：35℃；進樣體積：5 μL。梯 度 洗 脫（B 相）：0 min，20%；0.0 ～1.0 min，

20% →95%；1.0 ～5.0 min，95% →95%；5.0 ～5.5 min，95%→20%；5.5 ～8.0 min，20%→20%。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧正離子模式（ESI+），多反應監(jiān)測模式（MRM），載氣為氮氣，干燥氣溫度350 ℃，流量12 mL·min-1，霧化氣壓力35 psi[2-3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜多反應模式離子監(jiān)測條件優(yōu)化

分別取濃度為1 000 ng·mL-1環(huán)匹阿尼酸標準溶液和濃度為100 ng·mL-1內(nèi)標物（U-CPA）標準溶液，采用多反應監(jiān)測模式（MRM）進行優(yōu)化。①在SIM 模式下，確定環(huán)匹阿尼酸母離子為337.2，保留時間為2.619 min；內(nèi)標物母離子為357.3，保留時間為2.626 min，優(yōu)化毛細管出口電壓。②進行子離子掃描，使用已經(jīng)優(yōu)化好的參數(shù)，選擇定量離子和定性離子，優(yōu)化碰撞能量。③在MRM 模式下，對環(huán)匹阿尼酸和內(nèi)標物進行監(jiān)測。優(yōu)化后的MRM 條件見表1。

表1 環(huán)匹阿尼酸和內(nèi)標物的質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 色譜條件優(yōu)化

采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm×3.5 μm）反向極性色譜柱，ZORBAX 色譜柱基于傳統(tǒng)的全多孔填料顆粒，具有最高的載樣量和分離度。實驗結(jié)果表明該色譜柱對環(huán)匹阿尼酸分離度高；采用100 mm 長度進行分離，可以縮短分離時間，提高效率。分別選擇了純水-甲醇、純水（含0.1%甲酸）-甲醇、純水-乙腈、純水（含0.1%甲酸）乙腈作為流動相，對比發(fā)現(xiàn)流動相水相中加入甲酸分離度更好，峰型良好，無明顯前伸和拖尾。因此，選用含0.1%甲酸的純水-甲醇作為流動相。環(huán)匹阿尼酸總離子流圖見圖1。

圖1 環(huán)匹阿尼酸的總離子流圖（100 ng·mL-1）

2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量限

配制濃度為1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的8個濃度標準工作溶液。采取上述的儀器條件序列進樣，用MassHunter 定量軟件分析。以環(huán)匹阿尼酸濃度為橫坐標，以對應的定量離子峰面積與內(nèi)標物質(zhì)的峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。擬合直線回歸方程為y=0.593 793x+0.102 724。標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，說明線性關(guān)系良好。當環(huán)匹阿尼酸標準工作液濃度為1 ng·mL-1時，實時信噪比（S/N）為5，則以S/N=3 計算檢出限為0.6 ng·mL-1，以S/N=10 計算定量限為2.0 ng·mL-1。線性關(guān)系見圖2。

圖2 環(huán)匹阿尼酸的線性關(guān)系圖

2.4 精密度

選取濃度為80 ng·mL-1的標準工作溶液，按照上述方法連續(xù)進樣6 次，進行精密度的測定。結(jié)果顯示，計算得6 次數(shù)值的RSD 值為0.71%，表示精密度好。

2.5 黃酒樣品的測定與回收率

對市售38 批次黃酒樣品按照上述樣品制備方法進行前處理，按照優(yōu)化好的質(zhì)譜條件參數(shù)進行環(huán)匹阿尼酸定量檢測分析。其中7 批次樣品有檢出，5 批次樣品檢出值在定量限以上。具體含量見表2。

表2 黃酒樣品中環(huán)匹阿尼酸含量表

取同一空白黃酒樣品，分別向其中添加10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、120 ng·mL-1不同濃度的環(huán)匹阿尼酸標準溶液，做3個水平的添加回收，根據(jù)實際測得值計算回收率在99.7%～110.3%。

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對黃酒中環(huán)匹阿尼氨酸進行檢測，該方法線性關(guān)系好，精密度高，回收率在99.7%～110.3%，檢出限和定量限低，靈敏度高，重現(xiàn)性好；樣品前處理采用甲醇提取的方法，簡便快速高效，省略了煩瑣的前處理步驟，減少環(huán)節(jié)損失，提高了準確度。該方法可用于我國對黃酒產(chǎn)品的檢測分析和質(zhì)量控制。

慶陽黃酒以黃米為主要原料，小麥制曲，采用邊糖化邊發(fā)酵的開放式發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過程中容易受到雜菌污染，微生物繁殖代謝會產(chǎn)生有毒的次級代謝產(chǎn)物-環(huán)匹阿尼酸。環(huán)匹阿尼酸與黃曲霉毒素經(jīng)常在相似的條件下被同時發(fā)現(xiàn)，由此可知，如果釀造原料受到黃曲霉毒素污染，那么很大程度上會檢測出環(huán)匹阿尼酸[4]。此次實驗，通過對38 批次不同來源的慶陽市地產(chǎn)黃酒進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)有約18%的黃酒在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了微量的環(huán)匹阿尼酸。有實驗證明環(huán)匹阿尼酸會導致大鼠的肝、胰、脾、腎、唾液腺、心肌和骨骼肌產(chǎn)生退化性變化及壞死[5]。因此，對黃酒中的環(huán)匹阿尼酸檢測和控制很有必要，建議慶陽黃酒在生產(chǎn)中從原料選用到釀造、包裝、運輸過程中環(huán)環(huán)控制，步步監(jiān)測，減少污染的概率，切實提高黃酒產(chǎn)品品質(zhì)，發(fā)揚慶陽黃酒文化，打造慶陽黃酒知名品牌。