高效液相色譜法測定黃酒中苯甲酸含量的不確定度評定

苗 茜，張新中，彭 濤，劉笑笑

（蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅蘭州 730050）

黃酒以糯米、黍米等為原料，經(jīng)過蒸料，拌以麥曲或米曲，進行糖化和發(fā)酵釀制而成[1]。黃酒以其濃郁的香氣、醇厚的風味、豐富的氨基酸、有機酸和維生素而廣受消費者喜愛。然而，一些商家選擇添加苯甲酸這一廣譜抗微生物試劑來達到減緩微生物繁殖、延長保存期限的目的[2]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規(guī)定黃酒中不允許添加苯甲酸這一類防腐劑[3]。如果人們長期攝入過量的苯甲酸，會造成慢性苯中毒[4]，對人體造成嚴重損傷。通過黃酒中苯甲酸含量的不確定度的評定，分析不確定度來源，確定關鍵影響因素，不僅能夠保證黃酒中苯甲酸含量測定值的可靠性，也為提高實驗室檢驗檢測能力提供數(shù)據(jù)參考，為實驗室質(zhì)量控制提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

樣品：市售黃酒一批（13%VOL）。

標準物質(zhì)：苯甲酸（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.50%）。

試劑：甲醇（默克化學試劑，色譜純）、乙酸銨（國藥集團化學試劑，分析純）。

儀器：高效液相色譜儀（島津LC-20A）；萬分之一電子天平（梅特勒，ME204）；渦旋振蕩器（IKA，vortex2）；超純水機（密理博，Milli-Q）；高速離心機（艾本德，5810R）；超聲提取儀（新芝，SB-800DT）。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試樣樣品處理

精密稱取供試品（約2 g，精確至0.000 1 g）于50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，轉移至離心管中，3 900 r·min-1高速離心10 min，取上清液過0.22 μm水膜供液相色譜儀測定。

1.2.2 標準溶液配制

苯甲酸儲備液配制：精密稱取對照品99.50%苯甲酸11.01 mg至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1.095 mg·mL-1的標準溶液。

苯甲酸系列濃度溶液配制：準確移取苯甲酸貯備液0 mL、0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL 和0.24 mL 于10 mL 容量瓶中，定容配制成0 μg·mL-1、1.095 μg·mL-1、2.190 μg·mL-1、4.380 μg·mL-1、8.760 μg·mL-1、17.520 μg·mL-1和26.280 μg·mL-1系列濃度溶液。

1.2.3 計算公式

樣品中苯甲酸含量按式（1）計算。

式中：X為計算得出的苯甲酸含量，mg·kg-1；C為由標準曲線擬合出的樣品中苯甲酸含量，μg·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g；F為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 樣品測定

稱取兩份黃酒樣品，稱樣量分別為2.119 1 g 和2.000 5 g，經(jīng)前處理后上液相色譜儀測定，通過色譜峰面積和標準曲線計算出樣品中苯甲酸的濃度分別為1.541 μg·mL-1及1.740 μg·mL-1，求得樣品中苯甲酸的含量為0.036 36 g·kg-1和0.043 49 g·kg-1，苯甲酸含量平均值為0.039 92 g·kg-1。

2 不確定度來源分類與分析

根據(jù)國家計量技術規(guī)范《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2014）進行分類，苯甲酸測定不確定度的來源主要有A類不確定度和B類不確定度。其中，測量結果重復性（n）屬于A 類不確定度；而樣品稱量（m）、樣品定容（V）、標準溶液配制（s）、最小二乘法擬合標準工作曲線（C）以及加標回收率（rec）則屬于B 類不確定度[5-8]。

2.1 樣品稱量過程引入的不確定度urel(m)

（1）使用萬分之一天平（分辨率為0.1 mg）稱量0 ～50 g 時最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布，則不確定度：u1(d)==0.029mg，u1(m)== 0.29mg。

（2）供試品約5 g，取5 g 砝碼，重復稱重10 次，標準偏差為0.001 2 g，即1.2 mg。

樣品稱量的相對不確定度為urel(m)=

2.2 定容過程引入的不確定度urel(V)

（1）評定容量瓶配制溶液時的重復性帶來的標準偏差。對50 mL A 級容量瓶定容并稱重10 次，根據(jù)重量數(shù)值求其標準偏差，得到其標準偏差為0.050 mL。

（2）標定容量瓶帶來的標準偏差。50 mL A 級單標線容量瓶允許誤差為±0.05 mL，按三角分布，則u1(r)== 0.021mL。

（3）由溫度效應引入的不確定度。假設定容在（20±3）℃條件下進行，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4，u1(t)== 0.018mL。

樣品定容過程中引入的相對不確定度為

2.3 苯甲酸標準溶液引入的不確定度urel(s)

2.3.1 苯甲酸標準物質(zhì)含量引入的不確定度

2.3.2 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度

（1）標準物質(zhì)稱量需使用分辨率為0.01 mg 的天平，當稱樣量在0～5 g 時，允許誤差為±0.05 mg，按均勻分布，則不確定度為

（2）對照品稱樣量約10 mg，對10 mg 砝碼稱重10 次，根據(jù)10 次稱量值計算得出標準偏差為0.000 012 g，即0.012 mg。

標準物質(zhì)稱重引入的相對不確定度為

2.3.3 配制苯甲酸標準使用溶液引入的不確定度

使用容量瓶（25 mL、10 mL）和單標線移液管（5 mL、1 mL）來配制標準溶液。

（1）25 mL A 級容量瓶不確定度。容量瓶定容過程中允許誤差±0.03 mL，按三角分布，則u2(r)== 0.012mL。在（20±3）℃條件下進行測量，則溫度引入的不確定度：

其實，這只是里根演說前測試麥克風時的一句玩笑話。不過，當這段言論傳至蘇聯(lián)后，蘇聯(lián)不僅發(fā)表公開聲明譴責里根，還一度向特種部隊司令部命令“進入戰(zhàn)斗狀態(tài)”，美蘇險由此引發(fā)戰(zhàn)爭。

容量瓶重復性產(chǎn)生的相對標準不確定度如下。容量瓶中加水定容至刻度后稱重，重復10 次。根據(jù)測得重量值求得到其標準偏差為0.012 mL。

（2）10 mL A 級容量瓶不確定度。容量瓶定容過程中允許誤差±0.020 mL，按三角分布，則u3(r)== 0.008 2mL。在（20±3）℃條件下進行測量，則溫度引入的不確定度：

容量瓶重復性產(chǎn)生的相對標準不確定度如下。容量瓶中加水定容至刻度后稱重，重復10 次。根據(jù)測得重量值求得其標準偏差為0.008 mL。

則標準溶液稀釋定容引入的標準不確定度為

（3）1 mL A 級單標線移液管引入的不確定度。移液過程移液管允許誤差為±0.007 mL，按三角分布，則u1(y)== 0.002 9mL。在（20±3）℃條件下進行測量，則溫度引入的不確定度：

移液管重復性產(chǎn)生的相對標準不確定度如下。移液管準確移取純水后稱重，重復10 次。根據(jù)測得重量值求得其標準偏差為0.001 1 mL。

則標準溶液稀釋定容引入的標準不確定度為

（4）5 mL A 級單標線移液管引入的不確定度。移液過程移液管允許誤差為±0.015 mL，按三角分布，則u2(y)== 0.006 1 mL。在（20±3）℃條件下進行測量，則溫度引入的不確定度

移液管重復性產(chǎn)生的相對標準不確定度如下。移液管準確移取純水后稱重，重復10 次。根據(jù)測得重量值求得其標準偏差為0.001 9 mL。

則標準溶液稀釋定容引入的標準不確定度為

（5）標準溶液配制過程中稀釋引入的不確定度。標準溶液配制過程中，使用25 mL 和10 mL 容量瓶分別為2 次和6 次；5 mL 和1 mL 移液管分別為5次和6 次，則相對不確定度為

因此，標準使用溶液引入的不確定度

2.4 標準曲線計算引入的不確定度urel(C)

由標準曲線擬合引入的標準偏差計算公式為

本實驗中標準曲線方程為Y=64 186.7X-2 803.74。

由表1 計算，可得標準溶液系列濃度及響應值如表1 所示。

表1 標準溶液系列濃度及響應值

2.5 回收率引入的不確定度urel(rec)

由于樣品溶液不均勻或者實驗過程造成樣品的污染等因素，不可能100%的加以回收，本方法的加標回收率101%～103%，根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），b+=(103-100)%=3%，b-=(101-100)%=1%，則

2.6 重復測定6 次引入的不確定度urel(n)

表2 樣品獨立測定結果

2.7 總合成不確定度

表3 各組分相對不確定度

黃酒中苯甲酸含量為0.039 92 g·kg-1時，合成不確定度為0.039 92×0.042=0.001 7 g·kg-1，置信概率為95%時，k=2，擴展相對不確定度為0.003 4 g·kg-1。即稱樣量約為5 g 時，苯甲酸測量結果為0.039 92 g·kg-1，擴展不確定度為0.003 4 g·kg-1，k=2。

3 結論

基于高效液相色譜技術測定黃酒中苯甲酸的含量，通過分析操作過程中每個環(huán)節(jié)引入不確定度，發(fā)現(xiàn)標準工作曲線擬合對結果的準確性影響最大，苯甲酸加標回收率和標準溶液的配制方法對結果影響較大。因此，在標準溶液稀釋混勻和樣品溶液轉移過程中不能有漏液和轉移不充分的情況，應嚴格按照標準步驟進行，注意細節(jié)操作，以保證回收率的穩(wěn)定。另外，應選擇等級較高的標準品和量器（玻璃量器和移液器）來配制標準溶液系列濃度。測量時樣品濃度應盡量在標準溶液系列濃度中間區(qū)域，必要時可增加樣品的測定次數(shù)。通過分析和比較各個分量的相對不確定度，掌握影響真值的關鍵因素，不僅能有效提高數(shù)據(jù)準確性，也為實驗室質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。