不同硒形態對鎘脅迫下油菜鎘亞細胞分布、化學形態及硒累積的影響

張 立， 王 杰

(1.懷化職業技術學院，湖南懷化 418000； 2.湖南糧安科技股份有限公司，湖南邵陽 422008)

鎘(Cd)是一種在農田土壤中廣泛存在的重金屬元素，Cd具有高移動性、高毒害性以及不可生物降解等特性，且研究發現，Cd對植物光合作用、養分吸收及生理代謝具有顯著影響，低濃度下Cd可誘導植物活性氧(ROS)累積造成氧化應激損傷，從而導致植株發育遲緩，而高Cd濃度下植物可能會直接死亡，目前土壤Cd污染已成為威脅農作物安全生產的全球問題。油菜(L.)作為最具代表性的十字花科蕓薹屬植物，是我國種植面積最廣的油料作物，Cd脅迫可導致油菜籽產量銳減，菜籽油是居民日常的膳食輔料，超過每日攝入量限制的Cd含量會對人類健康造成危害。因此，降低油菜的Cd累積對保護人們免受Cd的威脅具有重要意義。

硒(Se)是人類和動物所必需的微量營養元素，盡管Se對高等植物來說不是必需的，但大量研究表明，一定劑量的Se對植物生長和提高非生物脅迫耐受性具有積極影響。近年來，Se在減輕植物重金屬(例如Cd)毒性方面的作用已越來越受到關注。周健等研究表明，外源硒代甲硫氨酸、硒酸鹽[Se(Ⅵ)]和亞硒酸鹽[Se(Ⅳ)]作為3種形態的硒源皆可有效提高小油菜的抗氧化酶活性，激活谷胱甘肽代謝，從而降低Cd脅迫對小油菜的應激損傷。徐境懋等研究發現，亞硒酸鹽[Se(Ⅳ)]處理可降低細胞可溶物質組分和細胞器組分的Cd含量，改變根系Cd的亞細胞分布，從而減少Cd向莖葉的轉運，降低地上部的膜脂過氧化程度。Lin等研究表明，外源Se(Ⅳ)可通過增加葉綠素含量和提高抗氧化活性來減少辣椒中的鎘積累，且Se有利于Cd脅迫下細胞膜和葉綠體結構的恢復和重建。上述研究表明，Cd脅迫下不同硒形態尤其是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)對植物具有良好的解毒作用。

土壤中存在不同形態的Se源，Se(Ⅳ)是淹水環境的主要形式，Se(Ⅵ)主要存在于堿性或通氣狀況良好的環境中。有機形式的Se是土壤硒的主要組成部分，與N、P等養分的有機形態不同，有機硒容易被植物根系吸收，研究發現小麥、油菜對硒代甲硫氨酸(SeMet)的吸收率是硒(Ⅵ)或硒(Ⅳ)的10～20倍。此外，隨著農業技術發展，通過生物或非生物途徑還原硒氧陰離子形成的納米級硒元素(SeNPs)已越來越多的應用于農業生產。目前已知Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet及SeNPs皆可被植物吸收，且關于Se對植物Cd吸收和轉運的影響已有較多報道，然而關于不同Se形態對重金屬脅迫的效果尚不清楚。基于此，本研究通過沙培試驗探索4種Se形態對油菜Cd累積、化學形態及生理特性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2021年3—5月在湖南糧安科技園(27°14′28″N，110°22′48″E)進行。供試油菜品種為中雙11，種子購自湖南糧安科技股份有限公司。種子采用5%HO進行表面滅菌5 min，采用蒸餾水沖洗，然后放置于鋪滿基質的園藝育苗盤中，在光照培養室(光—暗周期為12 h—12 h)中培養15 d。

供試土壤取自湖南省懷化市某電子拆卸區附近廢棄的油菜田。將土壤自然風干后采用溴甲烷(CH-Br)對土壤進行化學熏蒸，之后過4 mm網篩備用。供試土壤理化性質如下：有機質含量為28.26 g/kg、全磷含量為1.95 g/kg、堿解氮含量為96.40 mg/kg、速效磷含量為22.18mg/kg、速效鉀含量為141.72 mg/kg，pH值為6.27，鎘含量為 4.58 mg/kg。根據GB 15618—2018《土壤環境質量 農用地土壤污染風險管控標準(試行)》，當土壤pH值為5.5～6.5時，農田土壤污染Cd風險臨界值為0.30 mg/kg，供試土壤Cd超標14.27倍。

供試亞硒酸鈉(NaSeO)、硒酸鈉(NaSeO)、硒代甲硫氨酸(CHNOSe)均購自北京百靈威科技有限公司；納米硒(SeNPs)，粒徑25～45 nm，購自奧格生物技術(上海)有限公司。供試N、P、K肥分別為分析純的尿素、磷酸二氫鈣、硫酸鉀，均購自湖南化學試劑總廠。

1.2 試驗設計

試驗設置5個處理：對照(CK)，污染土培養；SeNPs，污染土培養中施用納米硒；Se(Ⅵ)，污染土培養中施用硒酸鈉；Se(Ⅳ)，污染土培養中施用亞硒酸鈉；SeMet，污染土培養中施用硒代甲硫氨酸。各處理重復3次。上述硒處理皆采用超純水進行高速攪拌，Se濃度為36 μmol/L。

盆栽裝置為桶形塑料制品，每盆裝土2.5 kg，將肥料(N=1.0 g，(N) ∶(PO) ∶(KO)=2 ∶1 ∶1)與土壤充分混合，保持70%土壤持水量，平衡6 d。之后每盆移入油菜幼苗3株，待幼苗進入生根期(10 d后)間苗至1株。之后加入相關硒溶液，為避免高劑量的硒對幼苗造成沖擊效應，采用多次分施，即每次施入30 mL相應硒溶液，連續 10 d，總量為300 mL。其他管理措施同作物培育方法，盆栽培育時間為38 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 油菜植株生物量、Cd濃度及Se濃度測定 培養38 d后，將油菜植株小心整株取出，將植株地上部、根系分開，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質量并記錄。將烘干的植株進行粉碎處理封裝待測，稱取0.50 g待測樣品，用HNO消解2 min，之后加入濃鹽酸進行酸解萃取，借助電感耦合等離子體光譜儀(ICAPQc，賽默飛世爾科技公司)采用電感耦合等離子體質譜法測定樣品中的Cd、Se濃度。

1.3.2 植株Cd亞細胞分布、Cd化學形態測定 Cd的亞細胞分布采用差速離心法分離測定，分為細胞壁、細胞器、細胞膜和可溶性部分，相關方法參考閆秀秀等所述略作修改。即準確稱取0.50 g新鮮油菜植株樣品，并用在4 ℃環境下預冷的40 mL混合提取液[250 mmol/L蔗糖、1 mmol/L二硫代甲狀腺素醇(DTT)、50mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH值為7.5]速研磨提取樣品，將勻漿采用 80 μm 孔徑的有機膜過濾，殘留濾渣記為細胞壁組分。將所得濾液在 3 000 r/min 離心30 min，沉淀物即為細胞器組分；隨后上清液以15 000 r/min進一步離心30 min后，上清液溶液、沉淀物分別為可溶性組分、細胞膜組分。

Cd不同化學形態分為乙醇提取態、水提取態、氯化鈉提取態、醋酸提取態、鹽酸提取態及殘渣提取態，上述提取分離參考Fu等所述采用逐步提取法測定，使用電感耦合等離子體質譜儀測量每個提取步驟中獲得的Cd濃度。

1.3.3 植株光合色素測定 葉綠素、類胡蘿卜素總量皆采用丙酮-乙醇混合浸提，采用紫外分光光度法分別在650、470 nm處測定，具體步驟參照李合生所述。

1.4 數據處理與統計分析

采用Excel 2013進行數據整理，采用SPSS 19.0進行試驗數據統計分析(=0.05)，采用Origin 9進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 不同硒形態對鎘脅迫下油菜生物量累積及色素含量的影響

由圖1-a可知，地上部干物質累積中，與CK相比，硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]變幅-35.43%～75.39%，其中Se(Ⅵ)處理累積量最低，顯著小于其他處理；以Se(Ⅳ)處理累積量最高，SeMet處理其次，二者間差異顯著，同時CK、SeNPs、Se(Ⅵ)處理較Se(Ⅳ)和SeMet處理分別顯著降低42.98%、45.12%、63.19%和28.94%、31.61%、54.12%。由圖1-b可知，各處理根系干物質累積量表現為Se(Ⅵ)

2.2 不同硒形態對鎘脅迫下油菜硒累積的影響

由圖2-a可知，各處理地上部Se濃度表現為CK

2.3 不同硒形態對鎘脅迫下油菜鎘累積及轉運的影響

由圖3-a可知，根系Cd濃度皆整體大于地上部。地上部Cd濃度中，與CK處理相比，硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]顯著降低32.94%～42.92%，硒處理中，以SeMet處理Cd濃度最低，其顯著低于SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)處理，此外，后三者處理間差異較小且差異不顯著；根系Cd濃度中，各處理呈SeMet

2.4 不同硒形態對鎘脅迫下油菜鎘亞細胞分布的影響

由圖4可知，使用差異離心法將植物亞細胞Cd組分分為4個部分：細胞壁、細胞器、細胞膜和可溶性部分。各處理不同組分中Cd累積比例差距較大，在根系中，CK處理中的Cd主要分布于細胞壁(49.91%)和可溶性部分(40.15%)，一小部分分布于細胞器(2.18%)和細胞膜(7.76%)中；同時，在硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]中，大部分Cd則存在于可溶性部分(47.51%～58.73%)中，這意味著硒處理下使Cd主要分布于可溶性部分，其中SeMet處理可溶性部分的Cd比例最高，較CK處理增加18.58%。

Cd在地上部中的亞細胞分布規律與根系趨于一致。由圖4可知，CK處理的油菜植株中Cd在細胞壁和可溶性部分中的比例較高，其中CK處理細胞壁比例高于SeNPs處理、Se(Ⅳ)處理和SeMet處理；而在可溶性組分中，硒處理的比例皆大于CK處理。然而，對于根系和地上部的Cd亞細胞分布，CK處理和各硒處理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]之間，細胞器和細胞膜中Cd比例波動較小。

2.5 不同硒形態對鎘脅迫下油菜鎘化學形態組成的影響

Cd在根系中的化學形態如圖5所示，各處理中的醋酸提取態和氯化鈉提取態的Cd形態在根系中占據主要地位，兩者Cd化學形態分別占總Cd累積量的20.17%～23.18%和17.35%～31.86%，而殘渣提取態的化學形態比例整體較低(9.05%～12.65%)。根系中，CK處理的水提取態的Cd占總Cd的19.09%，均高于硒處理(7.25%～13.77%)；而鹽酸提取態和乙醇提取態的Cd化學形態分別以 Se(Ⅵ) 處理(16.67%)、CK處理(20.63%)最高。

在地上部中，各處理的Cd化學形態規律與根系趨勢相似。即氯化鈉提取態和醋酸提取態的Cd組分在地上部中也占據主導地位，分別占總Cd含量的23.09%～38.61%和20.67%～26.96%。此外，在所有形式的硒處理中，氯化鈉提取態和鹽酸提取態的Cd比例均高于CK處理，而硒處理的乙醇提取態與水提取態Cd比例皆低于CK處理。

3 討論與結論

土壤Cd污染已成為制約農業安全生產的重要因素，已有研究表明，外源施用Se可有效降低植物對Cd的累積。本研究中，在Cd污染土壤中培養35 d后，與CK處理相比，除Se(Ⅵ)處理外，其他硒處理[SeNPs、Se(Ⅳ)、SeMet]均促進了油菜地上部、根系干物質累積，同時硒處理的葉綠素總量和類胡蘿卜素含量整體大于CK處理。葉綠素是光合作用的主要色素，參與光能的吸收、轉移、分配以及轉化過程，類胡蘿卜素是重要的抗氧化劑，逆境環境下兩者皆可激發PSⅡ光反應系統的活性從而維持植物養分代謝。Ahmad等研究表明，在重金屬脅迫下硒可提高植物葉綠體中的淀粉積累、抑制葉綠體降解，從而維持植株生理代謝。因此，本研究中Cd脅迫下硒可能是通過提高光合色素含量從而保證油菜植株的生長發育。

污染土壤中，Cd容易從土壤轉移至植物體內。前人研究表明，外源無機形態Se可降低污染土壤中小白菜、水稻、小麥等作物的Cd累積。本研究中，SeNPs、Se(Ⅳ)和SeMet處理均顯著降低了油菜地上部和根系的Cd濃度，并且有機態硒處理(SeMet)效果最佳，而Se(Ⅵ)處理中地上部Cd濃度顯著下降，但在根系中沒有顯著變化。這些結果表明不同硒形態對植株吸收Cd的阻遏能力不同，這可能是因為不同硒形態進入植物體的機制、數量以及在植株體內的同化差異所致。此外，本研究中，所有硒處理均顯著降低了Cd轉移系數，即亞硒酸鈉、硒酸鈉、硒代甲硫氨酸及納米硒4種形態硒皆可有效阻隔Cd向上運動。進一步研究表明，與無機形式的Se相比，有機硒處理(SeMet)的油菜植株硒含量最高；前人研究表明：有機硒是油菜作物吸收的主要硒形態，該研究結果與前人研究結果一致。以往的研究表明，硒主要通過水分吸收途徑被植物根系吸收，因此直徑越小的硒形態越容易穿過細胞壁，從而到達植株體內，因此植株的納米硒吸收量最高。然而本研究發現，SeNPs與Se(Ⅵ)的吸收量相當且皆顯著小于Se(Ⅳ)、SeMet，這意味著Se直徑并不是Se進入根系的先決條件。

在根系中，Cd在不同亞細胞組分比例表現為細胞壁>可溶性部分>細胞膜>細胞器，這種分布模式可能與植物緩解Cd脅迫的相應機制有關。在植物中，細胞壁是阻止Cd進入植物的首道屏障，但細胞壁對Cd的劫持能力有限，當細胞壁飽和后，可溶性部分的谷胱甘肽螯合Cd形成復合物，從而減少對細胞器的損傷。本研究表明，外源硒處理均降低了細胞壁中Cd比例，增加了可溶性部分中鎘的比例，這些結果表明，Se可以促進根系細胞壁和液泡螯合Cd；這一發現與Yu等的研究結果一致。Se的化學性質與硫相似，兩者皆可能通過刺激植物中GSH(谷胱甘肽)和PC(植物螯合素)的合成來促進Cd螯合。在植物中Cd首先被根系吸收然后轉移到地上部，因此植物中存在的Cd形態可直接影響遷移能力和活性。在本研究中，醋酸提取態和氯化鈉提取態的Cd比例在油菜植株中占主導地位，該結果與Wang等的研究結論一致。此外，本研究發現，Se的添加降低了根系中乙醇提取態和水提取態Cd的比例。這些結果表明，硒通過抑制根系到地上部的Cd易位來減少地上部中Cd的積累。綜上所述，硒增加了Cd在細胞壁和液泡中的螯合，降低了活性Cd的化學形式，從而減少了地上部Cd的積累。