杠板歸對豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因floR表達量的影響

唐遠江， 張 濤， 周思旋， 盧昱希， 楊茂生， 陶小艷， 趙 宇

(貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所，貴州貴陽 550005)

杠板歸為蓼科蓼屬植物杠板歸(L.)全草，具有清熱解毒、止咳作用，用于肺熱咳嗽、水腫尿少、濕熱瀉痢等。杠板歸的主要化合物是黃酮類、有機酸類、萜類等，但《中國藥典(2020版)》規定該藥材的主要檢測物質為槲皮素。杠板歸的煎煮劑、乙酸乙酯、正丁醇提取物對多種細菌具有較強的抑制作用，75%乙醇提取物具有廣譜抑菌活性，其中對耐藥性大腸桿菌的抑制作用明顯。

氟苯尼考抑菌能力強、吸收快，常作為仔豬腹瀉的預防保健藥，但長期濫用使得耐藥性日益嚴重，導致其藥效不佳，對養殖業造成嚴重影響，對人類健康也有嚴重危害。嚴重的耐藥現狀及物理、化學方法消除細菌耐藥性時對人類及動物的危害與日俱增，但中藥能有效消除細菌的耐藥性，同時這方面的研究能有效減少抗生素殘留，利于生產綠色動物產品。

貴州杠板歸藥材資源豐富，前期研究表明杠板歸59.92%乙醇提取物對耐藥性大腸桿菌具有較強抑菌作用，因此，本研究對杠板歸提取物耐藥基因表達量的影響進行探討，不僅可了解該基因畜牧養殖業中的耐藥現狀，還可為杠板歸在中獸藥的開發利用方面提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

大腸桿菌耐氟苯尼考菌株DF2、BY22、GL26、HS40、GP46分別從大方、白云、關嶺、惠水、高坡等豬場分離，大腸桿菌耐頭孢類、大環內酯類和四環素類菌株，均由筆者所在實驗室保存。

1.2 試劑和藥品

LB培養基，批號100224；DNA Maker；細菌總DNA、RNA提取試劑盒；槲皮素標準品，批號110957-20180；氟苯尼考，批號73231-34-2；反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。杠板歸59.92%乙醇提取物，由筆者所在項目組前期試驗研制。

1.3 主要儀器

Eppendorf AG熒光定量PCR儀，Veriti快速梯度PCR儀，廣州儀濤科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 藥品對大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)的測定 本試驗于2020年11月至2021年6月在貴州省畜牧獸醫研究所實驗室完成。試驗時利用LB培養基將培養24 h菌液稀釋500～1 000倍，將菌液濁度調節至0.5麥氏單位，藥品倍比稀釋成9個梯度，接種稀釋后的菌液1 mL至藥液(陰性對照)、菌液(陽性對照)、肉湯(空白對照)和試驗組，搖勻后在37 ℃下培養16～18 h。每個藥物作雙樣品測定，每組試驗中沒有細菌生長的藥物濃度為MIC。

1.4.2 氟苯尼考對亞抑菌濃度藥物處理后大腸桿菌MIC值的測定 將耐藥大腸桿菌培養過夜，將1%菌液接種于LB液體培養基中，試驗分為對照組和試驗組(培養基中加入提取物和槲皮素，使終濃度為亞抑菌濃度)，放置于37 ℃下培養5 h，測定方法同“1.4.1”節。

1.4.3 引物合成 參考文獻[16]的上游引物：5′-G C T C A A C G T G A G T T G G A T C A T A-3′，下游引物：5′-C A C T G C T G C T G A T G G C T C C T T T C-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

1.4.4 DNA提取及質粒構建 將培養過夜的大腸桿菌菌液提取DNA并進行PCR擴增，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序并合成質粒。

1.4.5 標準曲線構建 根據重組質粒的濃度和純度計算DNA拷貝數，倍比稀釋成1.0×10、100×10、1.0×10、1.0×10和1.0×10拷貝數質粒，分別不同質粒為模板進行熒光定量RCR擴增反應，每個拷貝數質粒重復擴增3次，以拷貝數為橫坐標，以值為縱坐標建立標準曲線，PCR反應體系見表1，反應程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 34 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 QPCR反應體系

1.4.6 熔解曲線分析 在反應完成后對擴增產物進行熔解曲線分析，檢驗是否存在引物二聚體或非特異性擴增。

1.4.7 敏感性試驗 將已知拷貝數的質粒DNA進行10倍倍比稀釋，反應完成后檢驗檢測方法的敏感性，每個稀釋倍數作3個重復。

1.4.8 重復性和特異性試驗 分別以大腸桿菌氟苯尼考、頭孢類、大環內酯類和四環素類耐藥菌株的DNA為模板進行檢測，每個菌株重復檢測3次，檢驗反應方法的特異性。

1.4.9 樣品基因的表達量變化檢測 將大腸桿菌分別用1/2(高)、1/4(中)、1/8(低)MIC的杠板歸提取物和槲皮素處理，按照試劑盒說明步驟提取供試大腸桿菌總RNA，反轉錄合成CDNA。擴增試驗設計為組內3次試驗，考察樣品基因的含量變化。

2 結果

2.1 杠板歸提取物對大腸桿菌的MIC值

由表2可知，杠板歸提取物和槲皮素對5株大腸桿菌均有抑制作用，但提取物對DF2、BY22不如槲皮素，對GL26、GP46的抑菌活性強于槲皮素，2種藥品對HS40的抑菌活性相差不大。

表2 杠板歸提取物和槲皮素對大腸桿菌的MIC值

2.2 氟苯尼考對亞抑菌濃度藥物處理后大腸桿菌MIC值的影響

由表3可知菌株經杠板歸提取物和槲皮素處理后氟苯尼考對菌液MIC值的變化。與對照組相比，DF2、HS40的MIC值分別下降51.38%、52.82%，BY22分別下降47.86%、73.57%，GL26的MIC值沒有變化，HS40的MIC值分別下降48.65%、52.70%，GP46分別下降76.76%、50.70%，試驗結果說明氟苯尼考對提取物處和槲皮素理后大腸桿菌的MIC值有不同影響，MIC值最高下降76.76%。

表3 氟苯尼考對大腸桿菌的MIC值變化

2.3 floR基因檢測及質粒構建

由圖1可知，通過基因檢測得出145 bp目的片段，無非特異性擴增。產物測序后結果與GenBank中的基因序列比對，相似度為98.7%～100.0%。PCR產物測序并合成質粒，質粒濃度為50.05 ng/μL。

2.4 標準曲線

由圖2可知，熒光定量的線性回歸方程為=-3.02×lg拷貝數+28.77，=0.999 2。

2.5 熔解曲線分析

由圖3可知，熔解曲線分析結果的熔解溫度為85.1～88.6 ℃，無引物二聚體和非特異性擴增。

2.6 敏感性試驗結果

分別對1.0×10～1.0×10拷貝數含量的7種質粒進行基因熒光定量PCR反應，由圖4可知，其靈敏度為1.0×10。

2.7 重復性和特異性試驗結果

根據建立的熒光定量方法檢測不同的大腸桿菌耐藥菌株，由圖5可知，大腸桿菌耐氟苯尼考菌株為陽性，且重復性較好，大腸桿菌耐頭孢類、大環內酯類和四環素類菌株均為陰性，提示該檢測方法的特異性強、重復性好。

2.8 floR基因表達量變化分析

由表4可知，不同劑量藥物處理大腸桿菌耐藥菌株后，與對照組相比，低劑量處理組中5株菌的值無變化，中、高劑量組值下降，其中，高劑量組變化明顯。選取對照組和高劑量(1/2MIC)處理組的值，采用2-ΔΔ法計算藥物處理前后基因表達量變化，利用GraphPad Prism7軟件作圖，相對表達量數值高表示基因表達量變化小，數值低表示基因表達量變化大。由圖5可知，通過提取物和槲皮素處理后，5株耐藥菌株的基因表達量均下降，其中對于菌株DF2、GL26，提取物的基因表達量分別是對照組的0.869 8、0.847 9倍，低于槲皮素試驗組的0.923 1、0.965 3倍，菌株BY22和GP46中提取物試驗組表達量為對照組的0.900 0、0.911 6倍，高于槲皮素試驗組的0.831 5、0.859 4倍，菌株HS40中2個試驗組的基因表達量變化不大，分別為0.897 5、0.897 9倍，提取物對5株耐藥菌的基因表達量分別下降13.02%、10.00%、15.21%、10.25%和8.84%。試驗結果提示杠板歸提取物和槲皮素可使豬源大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因表達量下降，其表達量變化大小因菌株而異。

表4 藥物處理前后floR基因CT值

3 討論

中藥活性提取液與抗生素混合使用后，可明顯改善細菌的耐藥性消除作用。張秀英等將大腸桿菌耐恩諾沙星菌株接種于十大功勞木醇提取物的營養肉湯中，傳代培養3～5代后，藥物對試驗菌株的MIC最高可降低32倍。采用1/2MIC的鐵冬青提取物傳代培養大腸桿菌，在第3代時氟苯尼考、阿莫西林和諾氟沙星等對試驗菌株的MIC由 640 μg/mL 降至0.625 μg/mL以下，消除效果明顯。本研究通過試驗得出杠板歸提取物和槲皮素對5株大腸桿菌均有抑制作用，氟苯尼考與提取物和槲皮素聯合作用后對5株大腸桿菌的MIC值可下降1/2或1/4，由此可見，聯合作用多次傳代培養后，提取物和槲皮素對氟苯尼考的耐藥消除作用明顯。

熒光定量PCR中絕對和相對定量法差異明顯，王大濤通過梅花鹿P21基因的檢測比較相對和絕對熒光定量PCR表明，絕對定量結果的準確性明顯優于相對定量。由于本試驗采用不同方法處理不同樣品從而得到目標基因的表達量有差異，因此本試驗采用絕對定量方法檢測目的基因的表達量，同時根據基因序列建立豬熒光定量PCR檢測方法，檢測靈敏度達1.0×10拷貝數，確保基因表達變化的精確性。在計算基因表達量變化時，2-ΔΔ法必須引入看家基因作為內參，檢測過程繁瑣且擴增效率對試驗結果存在較大的影響，2-Δ聯合標準曲線法計算值方便，最能測得目的基因的表達量差異，同時也能節省試劑材料。

基因在能量驅動下，細菌體內產生外排泵將藥物或毒物排出體外，從而對抗生素產生耐藥性，在耐藥菌株與敏感菌株間傳遞使得耐藥性廣泛傳播。多種中藥通過消除細菌耐藥質粒而降低細菌的耐藥性，研究表明艾葉醇提液對耐慶大霉素大腸桿菌的耐藥質粒消除率可達69.4%，從而使得慶大霉素對大腸桿菌有明顯抑制作用。本試驗通過熒光定量方法得出藥品處理后基因表達量變化，發現杠板歸提取物和槲皮素可使耐藥基因表達量明顯下降，其表達量變化大小因菌株而異，杠板歸提取物使5株菌的基因表達量分別下降13.02%、10.00%、15.21%、10.25%和8.84%，表明大腸桿菌基因表達量與其耐藥程度具有一定關系，且杠板歸提取物對改變大腸桿菌基因表達量與耐藥性具有一定作用，提示杠板歸提取物可作為大腸桿菌耐藥基因的抑制劑。杠板歸提取物由于是粗組分，很難闡述清楚該中藥對基因的消除機制，因此后續研究應集中在藥材處理耐藥細菌后的代謝途徑、轉錄組、蛋白組學進行研究，深刻探討中藥的藥用機制，同時也為杠板歸開發運用及消除耐藥機制研究提供參考。