基于多酶輔助信號放大的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇高靈敏免疫檢測方法的建立

陳 斌， 曾 昆， 吳琴燕， 楊 健， 顧鑫凱

(1.江蘇大學環境與安全工程學院，江蘇鎮江 212013； 2.江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇鎮江 212013)

真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物，極易在作物生長、收獲及糧食儲藏過程中產生。在我國，由于人們的傳統飲食規律，谷物食用比例遠高過西方國家，使得真菌毒素危害十分明顯。其中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是從被禾谷鐮刀菌污染的玉米中分離出的一種真菌毒素，并且是糧食作物中常見的污染毒素之一，因其能夠引起嘔吐，故又稱嘔吐毒素。DON能夠直接污染農作物，然后通過農作物進入到人或動物體內，能夠誘發嘔吐，導致動物出現厭食、胃腸炎、腹瀉、生長緩慢，甚至還會產生免疫抑制或血液病等。有研究表明，90%感染真菌毒素的樣本里均含有DON。我國規定谷物及其制品中DON的限量標準為1 mg/kg，聯合國食品添加劑專家委員會規定人體對DON及其衍生物每日最大耐受攝入量為1 μg/kg。郭紅衛等在對我國河南地區及上海市赤霉病流行年份與非流行年份小麥中鐮刀菌污染情況進行調査時，發現DON含量的中位數分別為933.0、14.2 mg/kg，遠高于我國規定的限量標準。常規真菌毒素檢測以儀器分析方法為主，包括高效液相色譜法、液質聯用等技術，盡管靈敏度高、準確性好，但這些儀器分析均需要專業技術人員操作，且儀器設備成本高，前處理過程復雜，不能滿足大規模樣本快速分析需求。免疫分析方法具有靈敏度高、特異性好等優點，適用于大量樣本的現場篩查，已廣泛應用于食品安全、環境監測、臨床診斷等領域。

免疫分析方法是基于抗原-抗體的特異性結合，結合酶、熒光物質、納米顆粒等報告分子，輸出檢測信號。憑借高效催化作用、專一性等特點，酶在免疫分析方法中應用最為廣泛，為高靈敏度分析方法的構建提供了重要元件。借助納米顆粒、聚合物、抗原-抗體、生物素-親和素等系統，將多個酶共同組裝在一起而形成多酶顆粒，極大增加了單位反應單元的酶數量，提高了檢測信號值，從而達到提升檢測靈敏度的目的。納米科技的發展為多酶顆粒的制備提供了多種可能，新型的納米材料，例如納米金顆粒(AuNPs)、碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)等，具有尺寸小、比表面積大、荷載量大等優勢，可作為酶的載體，并且這些納米材料還可較好地保存酶的催化活性，避免在苛刻條件下酶活性的喪失。筆者所在研究組前期分別合成了基于AuNPs和CNTs的多酶顆粒，發現以CNTs為載體的顆粒能夠荷載更多的蛋白酶分子，具有更高的催化效率，并且對于免疫分析方法靈敏度的提升更為顯著。

本研究以CNTs為載體，荷載酶蛋白分子，構建通用型的多酶信號顆粒，建立多酶輔助信號放大的DON免疫分析方法，并對市售谷物樣本進行檢測。該方法操作簡單、快速、靈敏度高，可為谷物中DON的檢測與監測提供有力的技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊抗鼠酶標二抗(HRP labelled Goat anti-mouse antibody，GAM-HRP)，購自美國Jacket公司；明膠和3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB)，購自美國Sigma公司；超高純羧基化單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNTs)，購自江蘇先豐納米材料科技有限公司；DON單克隆抗體以及DON包被原 OVA-DON，購自深圳市科捷實業發展有限公司；其他常規試劑購自國藥集團。

多功能酶標儀(奧地利Infinite公司，Infinite M1000 PRO)；磁力攪拌器 (德國IKA公司，C-MAG HS4)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司，5415D)。

1.2 試驗方法

1.2.1 間接競爭ELISA方法檢測DON的流程 在酶標板中，每孔加入100 μL適量稀釋的OVA-DON，4 ℃過夜；倒掉孔內液體，拍干后每孔加入封閉液200 μL(PBS，0.01 mol/L，pH值7.4，含1%明膠)，37 ℃孵育2 h，倒掉孔內液體，拍干；采用PBS(0.01 mol/L，pH值7.4)將DON標準品配制成系列濃度，在每個孔中加入50 μL DON標準品，再加入 50 μL 經過適度稀釋后的DON抗體，在37 ℃下孵育培養30 min；采用PBST(含0.5% Tween-20 PBS)洗滌3次并拍干，每個孔中加入100 μL適度稀釋后的GAM-HRP ，37 ℃下孵育30 min；PBST洗滌3次并拍干，后在每個孔中加入現場配制的TMB顯色液100 μL，37 ℃孵育10 min；最后每孔加入50 μL終止液(2 mol/L HSO)，并用酶標儀檢測 450 nm 處吸光度。以DON標準品濃度的對數為橫坐標，為縱坐標繪制標準曲線，其中，為不同濃度標準品對應的值，為標準品濃度為0時，對應的值，即最大值。計算半數抑制濃度(IC)、最低檢測限(IC)和檢測范圍(IC～IC)。

1.2.2 條件優化

1.2.2.1 最適抗原抗體濃度優化 通過使用棋盤法進行研究，尋找抗原抗體的最佳反應濃度。酶標板每行包被不同濃度的OVA-DON，每孔加入 100 μL，4 ℃過夜；洗滌及封閉同“1.2.1”節；將DON抗體用PBS緩沖液分別稀釋至不同濃度，并依次加入至不同列孔板中，每孔100 μL，37 ℃孵育 30 min；其余洗滌、加入酶標記物、顯色、終止等流程同“1.2.1”節。經過試驗，把陽性對照/陰性對照(Positive/Negative，P/N)≥2.1，且吸光度達約1.0時的抗原及一抗濃度作為最佳反應濃度，其中 P/N=(-)/(-)。

1.2.2.2 最適理化條件的優化 (1)最適pH值：配制pH值分別為6.0、7.0、7.4、8.0 0.01 mol/L PBS緩沖液，采用上述緩沖液稀釋DON標準品，按“1.2.1”節方法進行檢測，每組設置3個平行，繪制標準曲線并計算IC。(2)最適離子強度：分別配制離子強度為0.01、0.05、0.1、0.15、0.20 mol/L的PBS緩沖液(pH值依據上述試驗獲得)，采用上述緩沖液稀釋DON標準品，按“1.2.1”節方法進行檢測，每組設置3個平行，繪制標準曲線并計算其IC。(3)最適有機溶劑用量：分別配制含有0%、10%、20%、30%及50%甲醇的PBS緩沖液(pH值和離子強度依據上述試驗獲得)，采用上述緩沖液稀釋DON標準品，按“1.2.1”節方法進行檢測，每組設置3個平行，繪制標準曲線并計算其IC。

1.2.3 SWCNTs多酶信號顆粒的制備與評估

1.2.3.1 SWCNTs多酶信號顆粒的制備 0.2 mg羧基化SWCNTs，超聲懸于1 mL MES溶液中，至SWCNTs完全分散；加入一定量的GAM-HRP，4 ℃混合攪拌過夜；5 000/min離心10 min，去除上清液；將沉淀SWCNTs/GAM-HRP超聲重懸于1 mL 含有2% BSA的MES溶液中，4 ℃保存備用。對SWCNT上結合的GAM-HRP用量進行優化，分別加入20、40、60、80 μg GAM-HRP，產物分別命名為SWCNTs/GAM-HRP-1、SWCNTs/GAM-HRP-2、SWCNTs/GAM-HRP-3和SWCNTs/GAM-HRP-4。

1.2.3.2 SWCNTs多酶信號顆粒的評估 應用“1.2.1”節和“1.2.2”節所建立優化后的DON間接競爭ELISA方法，將其中使用的GAM-HRP替換為“1.2.3.1”節中合成不同SWCNTs/GAM-HRP，評估多酶顆粒的結合能力和信號放大效果。

1.2.4 基于多酶輔助信號放大的嘔吐毒素檢測方法的建立與優化

1.2.4.1 基于多酶輔助信號放大的嘔吐毒素檢測流程 包被、封閉、DON抗體競爭結合步驟與“1.2.1”節相同；加入不同濃度SWCNTs/GAM-HRP顆粒，振蕩條件下37 ℃孵育30 min；顯色、終止及讀值步驟同“1.2.1”節。

1.2.4.2 條件優化 為進一步提升方法性能，對DON抗體的工作濃度及SWCNTs/GAM-HRP顆粒的工作濃度進行優化。DON抗體設置3個工作濃度(1 ∶2 000、1 ∶4 000和1 ∶6 000)，SWCNTs/GAM-HRP設置3個工作濃度(1 ∶10、1 ∶20和1 ∶40)，同時設置不同DON標準品濃度(0.0、0.1、1.0 ng/mL)及空白對照(競爭步驟中，不加DON抗體以及DON標準品)。將不同濃度的DON抗體與不同濃度的SWCNTs/GAM-HRP進行交叉匹配，選擇靈敏度最高的組合。

1.2.5 方法的性能評估

1.2.5.1 間接競爭性標準曲線 基于“1.2.4”節中優化條件，按照“1.2”節中試驗流程，分別配制DON標準品濃度為1、2、4、8、16 ng/mL，并繪制標準曲線，每組試驗設3個平行。計算半數抑制濃度(IC)、最低檢測限(IC)和檢測范圍(IC～IC)。

1.2.5.2 交叉反應 選取DON結構類似物及不同真菌毒素(3-Ac-DON、15-Ac-DON、T-2毒素、ZEN、AFB1)做交叉反應的測定，對本試驗方法的特異性進行評價。交叉反應(cross reactivity，CR)=IC(DON)/IC(類似物)×100%。

1.2.5.3 精密度 將基于多酶輔助信號放大的DON檢測方法的標準曲線進行重復測定10次，第2天再次檢測，計算批內和批間變異系數(coefficient of variation，CV)。

1.2.6 谷物樣本的檢測

1.2.6.1 添加回收試驗 把大米、玉米和小麥的陰性樣品進行粉碎，粉碎后通過20 目篩，稱取10 g，加入20 mL 20%甲醇溶液，振蕩2 min，取1 mL上清液于4 000/min離心5 min，吸取上清液，并稀釋10 倍，配制終濃度為0、1、4、8 ng/mL DON溶液，按“1.2.4.1”節方法進行檢測。每種添加濃度重復3次，添加回收率=(檢測濃度-本底濃度)/實際添加濃度×100%。

1.2.6.2 實際樣本檢測 在江蘇省鎮江市大型超市中，采購大米、玉米和小麥樣本各5種，應用“1.2.4.1”節方法進行檢測。

2 結果與討論

2.1 DON間接競爭性ELISA的建立

ELISA方法的建立是基于抗原與抗體的特異性反應，其中，包被原的濃度、抗體的濃度、反應的條件等均會不同程度地影響方法性能，因此需要對其進行優化。首先，采用棋盤法對抗原和抗體的濃度進行優化，由表1可知，通常選擇值在1.0左右的配對濃度作為最適條件，其中，包被原1 ∶500/抗體1 ∶8 000、包被原1 ∶1 000/抗體1 ∶4 000和包被原1 ∶2 000/抗體1 ∶2 000這3組均符合此條件。其中，第1組空白值偏高，選擇包被濃度較高的一組(包被原1 ∶1 000/抗體1 ∶4 000)為最適工作濃度。

表1 棋盤法篩選最適抗原與抗體濃度

其次，對反應的條件進行優化，包括pH值、離子強度以及有機溶劑含量。由圖1可知，pH值在 6.0～7.4時，值變化不大，當pH值達8.0時，值略有增加；同時，當pH值為7.4時，IC值最低。溶液的離子強度越高，值越小，而IC值隨離子強度增加而增加。當離子強度為0.01 mol/L時，值最高而IC值最低。在實際樣本檢測時，需要加入有機溶劑作為提取液，因此，需要評估有機溶劑對反應的影響，選擇常用的甲醇進行評估。該方法對甲醇的耐受性較好，當甲醇濃度低于30%時，值和IC值變化不大，當甲醇濃度達50%時，靈敏度顯著下降。最終選用0.01 mol/L PBS (pH值7.4，含20%甲醇)作為樣品溶液來稀釋DON標準品。

基于以上優化條件，建立DON間接競爭檢測標準曲線(圖2)。該方法線性范圍8.85～35.17 ng/mL，IC為18.13 ng/mL，檢測限為3.12 ng/mL。

2.2 SWCNTs多酶信號顆粒的優化

以碳納米管為載體，可荷載較多的蛋白酶顆粒放大檢測信號，還可有效保留酶的活性。由圖3可知，本研究中，將GAM-HRP偶聯在SWCNTs上，形成一種通用的信號放大探針，可適用于間接ELISA方法，用于替代傳統的酶標二抗，提升靈敏度。納米材料上荷載的酶蛋白的量與方法的靈敏度直接相關，因此對GAM-HRP的用量進行優化。隨著GAM-HRP用量的增加(從20 μg至80 μg)，同等條件下顯色的值顯著增加。因此，后續試驗中GAM-HRP的用量為80 μg，即采用SWCNTs/GAM-HRP-4作為信號放大元件。

2.3 基于多酶輔助信號放大的嘔吐毒素檢測方法的建立及優化

引入合成的SWCNTs/GAM-HRP-4，構建多酶輔助信號放大的嘔吐毒素檢測方法。由表2可知，由于酶促信號的放大作用，對DON抗體和多酶信號顆粒的用量再次進行優化，同時設置不同的DON標準品，幫助評估每一種條件下方法的靈敏度。選擇的標準為：(1)當DON標準品為0 ng/mL時，顯色值在1.0左右；(2)不同的DON濃度條件下，顯色呈現明顯的梯度為佳；(3)為避免多酶信號顆粒吸附造成的背景干擾，空白值應盡可能小。根據以上條件，發現當 SWCNTs/GAM-HRP-4用量較大(1 ∶10)時，整體背景值均較高(空白超過0.1)；在試驗中，通過增加洗滌次數、提高洗液中的表面活性劑Tween-20的含量，均不能有效降低背景。SWCNTs/GAM-HRP-4用量為1 ∶20和1 ∶40時，背景值均較低。在DON抗體(1 ∶12 000)/SWCNTs/GAM-HRP-4(1 ∶20)和DON抗體(1 ∶8 000)/SWCNTs/GAM-HRP-4(1 ∶40)這2組條件，最大的值均在1.0左右，同時前一組合在不同DON濃度下，梯度變化趨勢更為明顯，靈敏度更高。因此，確定最適的DON抗體濃度為1 ∶12 000，SWCNTs/GAM-HRP-4最適濃度為1 ∶20。

表2 DON抗體和多酶信號顆粒的用量優化

基于以上優化后的反應條件，建立了基于多酶輔助信號放大的DON標準曲線。由圖4可知，該方法的線性范圍為0.93～9.40 ng/mL，IC為 3.93 ng/mL，檢測限為0.63 ng/mL。相對于間接競爭ELSA方法，本方法的靈敏度提高約5倍(3.12 ng/mL 至0.63 ng/mL)。在對方法進行優化的過程中，發現在同樣的包被濃度條件下，基于多酶輔助信號放大的ELISA方法中抗體的用量(1 ∶12 000)遠小于間接競爭ELSA方法(1 ∶4 000)。在與同樣濃度的包被原和標準品競爭結合時，抗體越少，越容易被標準品完全抑制，顯示出更高的靈敏度；但同時也會導致與包被原結合減少，信號強度降低，因此通過SWCNTs/GAM-HRP有效信號放大，保障了信號強度，使得靈敏度顯著增加。與已報道的DON免疫分析方法相比(靈敏度分別為9.83 ng/mL、1.0 ng/mL、2.97 ng/mL)，所建立的新方法具有較好的靈敏度，能夠滿足食品中DON檢測的要求。

交叉反應結果見圖5。由圖5可知，所建立的新方法僅與3-Ac-DON有較弱的交叉反應(4.4%)，與 15-Ac-DON、T-2、ZEN、OTA和AFB1無明顯的交叉反應，這表示本方法具有良好的特異性。由表3可知，本方法的批內差在3.67%～9.09%，平均值為7.27%；批間差在4.72%～13.78%，平均值為9.57%。批內差和批間差均小于15%，表明該方法具有較高的精密度。

2.4 谷物樣本的檢測

為評價新構建方法的實際應用性，對大米、小麥和玉米3種谷物的樣品進行加標回收試驗。由表4可知，方法回收率在87.65%～114.50%之間，這個數據表明新方法在實際谷物樣品DON的檢測中具有較高的準確性。于7月在鎮江市吉麥隆及大潤發超市中采集了大米、小麥和玉米樣品各5個，采用建立的新方法進行檢測。由表5可知，15個樣本中DON檢出濃度在

表3 ELISA方法的批內和批間差異

表4 基于多酶輔助信號放大的DON檢測方法添加回收試驗

3 結論

新型納米材料的發展為免疫分析方法中信號放大策略提供了新的契機。本研究以SMWCNTs為載體，荷載GAM-HRP，構建通用型的多酶信號顆粒，建立了多酶輔助信號放大的嘔吐毒素免疫分析方法；相較于間接競爭ELSA方法，該方法的靈敏度提高了約5倍(3.12 ng/mL至0.63 ng/mL)；同時具有良好的特異性、準確性。對大米、小麥和玉米加標試驗顯示，回收率在87.65%～114.50%之間；在15個谷物樣本中DON檢出濃度在

表5 實際樣本檢測結果