不同處理方式對鮮切天麻貯藏軟化相關酶表達的影響

孫海燕， 田 蕓， 郝丹青， 王 瑞， 裴金金， 陳 琛， 李新生，2

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中 723000； 2.陜西理工大學/陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中 723000；3.國家農產品保鮮工程技術研究中心秦巴地區保鮮工作站，陜西漢中 723000；4.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550000)

天麻(Bl.)又稱赤箭、離母、神草等，屬于蘭科植物，廣泛分布于秦巴山區，是一種傳統的名貴中藥材。天麻的主要有效成分是天麻素及其苷元、天麻多糖，對頭痛失眠等癥狀有較好的治療作用。目前，天麻主要作為藥材使用，在市面上以干品居多，新鮮樣品較少，這是因為天麻的采收時間較短，新鮮天麻容易潰爛，不易保鮮，一般僅可自然放置5～7 d。傳統的天麻貯藏大多采用保鮮劑、真空包裝、低溫冷藏等方法，在一定程度上可以延長天麻的保鮮時間。目前，國內外對天麻保鮮的研究較少，國內已有的報道主要集中于鮮食天麻貯藏工藝及鮮食天麻與傳統干制天麻貯藏方法的比較，也有一些報道是關于天麻失質量率、可食率、口感、硬度、色度等進行的研究。至今，天麻軟化相關酶是否會影響其后續保鮮效果尚仍不清楚。天麻在采收后仍具有活性，在其貯藏期間會逐漸軟化，活性物質會被降解，不利于保鮮；天麻軟化是一個非常復雜的發育調控過程，包含一些生理生化反應，包括細胞壁的降解、內含物的變化、呼吸速率的變化等，可能有多種軟化相關酶參與調控。果膠裂解酶(PL)是一種通過降解果膠使果實軟化的酶，可以隨機裂解高等植物的中膠層和初生細胞壁，主要功能是在果實成熟過程中參與果膠結構的裂解以達到軟化果實的目的；果膠甲酯酶(PME)能夠催化細胞壁中多聚半乳糖醛酸的脫甲酯化，可以使植物細胞壁中的果膠多糖降解；過氧化物酶(POD)隸屬于氧化還原酶類，廣泛分布于大自然中，是造成植物木質化的關鍵酶之一；木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中，是一種催化活性很強的蛋白水解酶；組織蛋白酶是蛋白酶類的一種，其主要功能是降解蛋白質。

本研究所用天麻取自陜西省漢中市南鄭縣青樹鎮，采收當天運回實驗室，篩選無損傷且大小均一的天麻。成熟天麻為黃褐色塊莖，取新鮮天麻，清洗干凈后切成塊狀，采用茶多酚涂膜、超高壓處理、茶多酚涂膜+超高壓處理3種方式處理，用聚乙烯保鮮袋保存于4 ℃冰箱中，以備后續試驗使用。本試驗以3種不同處理方式處理的天麻樣品為材料，首先進行表型分析，然后提取樣品RNA，進行反轉錄后用qPCR檢測天麻軟化調控相關酶的表達規律，為進一步從分子水平揭示天麻軟化機制和保鮮效應奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2019年3月于陜西省漢中市略陽縣采挖新鮮天麻，當天運回實驗室后，用清水清洗、晾干、去皮后切成1 cm厚的片狀，用3種不同方式處理(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)后，各個處理均稱取(250±2) g裝入聚乙烯塑料袋中，封口后存放于4 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑及儀器

總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(TaKaRa)、qPCR試劑盒、SYBR Premix Ex[寶生物工程(大連)有限公司，TaKaRa]；三氯甲烷、異丙醇、75%冷乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)水[上海科拉曼試劑有限公司]；TRIzol(西安熱默爾生物科技有限公司)。PCR擴增儀(美國伯樂公司)、恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表有限公司)、離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)、電子分析天平(奧豪斯公司)、蛋白核酸分析儀(美國Thermo公司)、電泳儀(北京君意東方電泳設備公司)、凝膠成像(英國Syngene公司)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 選取新鮮天麻，分別用3種方式(茶多酚涂膜、超高壓、茶多酚涂膜+超高壓)進行處理。(1)茶多酚涂膜。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液，陰涼避光處晾干后，裝入聚乙烯袋中保存。(2)超高壓處理。將新鮮天麻裝入聚乙烯袋中，封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。(3)茶多酚涂膜+超高壓處理。在新鮮天麻表面均勻噴涂1.5%茶多酚保鮮液后，于陰涼避光處晾干，再將其裝入聚乙烯袋內，封口后在20 ℃、300 MPa條件下超高壓處理10 min。

1.3.2 取樣及表型觀察 每7 d取樣1次，每次取出2片鮮切天麻，觀察樣品表型差異并拍照記錄。再將樣品切成小塊，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.3 RNA的提取 提取用不同方式處理的天麻樣品RNA的具體步驟如下：(1)取2 mL離心管，加入1 mL TRIzol，將試驗樣品和研缽(160 ℃滅菌)從-80 ℃冰箱中取出，先向研缽中加入液氮預冷，再將樣品放入研缽中研磨，邊研磨邊補充液氮，研磨至粉末狀，用藥匙將粉末加入離心管中，做好標記；(2)室溫靜置10 min使粉末充分裂解，于12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，去除組織碎片，小心吸取上清(紅色)至新的2 mL離心管中；(3)向離心管中加入 200 μL 三氯甲烷(TRIzol體積的1/5)，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15 s，待液體充分乳化后，冰上靜置 5 min，于12 000 r/min、4 ℃離心15 min；(4)從離心機中取出離心管，此時勻漿分為3層，上層為無色水相上清(RNA所在層)，中間層為白色蛋白層，下層為有機層，小心吸取上清液轉移至新的離心管中并做好標記，勿吸取白色中間層；(5)向上清液中加入與上清液等體積的異丙醇，上下輕柔顛倒，于室溫靜置10 min；(6)于12 000 r/min、4 ℃離心10 min；(7)輕輕倒掉上清液，沿離心管壁緩慢加入1 mL 75%預冷乙醇(提取RNA專用)，輕輕上下顛倒洗滌沉淀，于12 000 r/min、4 ℃離心5 min，小心倒掉75%乙醇；(8)室溫下干燥沉淀2～5 min，待乙醇完全揮發后，加入60 μL DEPC水溶解沉淀；(9)用核酸定量儀測定RNA濃度，于-80 ℃保存備用。

1.3.4 RNA反轉為cDNA 參照PrimeScript(TaKaRa)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應，合成相應的cDNA。1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL樣品RNA，補加Rnase Free dHO至10 μL，于42 ℃水浴2 min，即可得到消除基因組的DNA體系。在上述體系中，加入Reaction solution from Step 1 10 μL，5×Primerscript Buffer 2 4 μL，Primerscripr Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，Rnase Free ddHO 4 μL，渦旋混勻，置于PCR儀中進行反轉錄，反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.3.5 引物的設計 為了篩選天麻中的軟化酶，本研究在美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫中查閱相關文獻，以了解軟化相關酶的種類，由于天麻軟化相關酶基因在NCBI數據庫上未見公布，因此選取與其同科植物的相關基因序列，用BLAST進行比對，選取高度保守的序列，結合引物設計的原則，用Primer 5.0軟件，每個基因設計2～3對引物，共設計22對引物。

1.3.6 通過普通PCR法篩選引物 以cDNA為模板，按照PCR反應體系將所需試劑依次加入PCR管中，具體反應體系為0.6 μL模板DNA，7.5 μL Mix，0.7 μL上游引物，0.7 μL下游引物，5.5 μL滅菌水，總體積15 μL。反應程序為：95 ℃預變性 2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，循環34次；72 ℃ 延伸30 s，72 ℃充分延伸10 min，12 ℃保存。

1.3.7 Real-time qPCR檢測軟化相關酶編碼基因的mRNA表達水平 Real-time qPCR的具體操作參照TaKaRa的說明書，每個基因做3個重復，20 μL 反應體系：10 μL SYBR，1.6 μL上游引物(10 μmol/L)，1.6 μL下游引物(10 μmol/L)，2 μL cDNA模板，4.8 μL ddHO。采用兩步法PCR反應程序，具體反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，循環50次；95 ℃延伸 15 s，72 ℃充分延伸10 min，12 ℃保存。

1.4 數據統計

用Excel 97-2003進行數據整理并分析結果。

2 結果與分析

2.1 天麻保鮮過程中的表型分析

本試驗每隔7 d取樣1次，同時拍照記錄樣品的表型。經統計發現，天麻在保鮮過程中的表型變化具有以下特征：(1)天麻在自然條件下(空白對照組)逐漸變軟，顏色由白色變成淡黃色；(2)經茶多酚涂膜的天麻顏色與空白組相比差異不顯著，用刀不易切開；(3)經過超高壓處理的天麻整體變脆，很容易用小刀切成塊狀，且有汁液流出；(4)用茶多酚涂膜并進行超高壓處理的天麻水分較多，取樣后袋中有較多汁狀液體殘余，相較于其他3種處理方式樣品的顏色更深(圖1)。

2.2 RNA質量的檢測

為了檢測RNA的質量，隨機選取部分RNA樣品，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖2可以看出，所有樣品總RNA的28S、18S RNA主峰單一、清晰無降解，說明提取的RNA質量較好，可用于后續研究。

2.3 引物的篩選

由于在NCBI等數據庫中未檢索到天麻軟化相關酶的編碼基因序列，因此本試驗選取多個與天麻同科或同種植物軟化相關酶的編碼基因序列，經BLAST軟件比對，選取高度保守序列，結合引物設計原則，用Primer 5.0工具，每個基因設計2～3對引物，共設計22對引物，其中為內參基因引物，引物序列見表1。

表1 天麻軟化表達酶相關基因引物

用PCR擴增后，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖3、圖4可以看出，只有組織蛋白酶(Cathepsin)和過氧化物酶(POD)擴增出相應條帶，其他引物均未檢測到條帶。

2.4 天麻軟化相關酶的表達趨勢

以空白樣(處理0 d)為對照進行數據處理，并繪制成折線圖。由圖5可以看出，28 d前，PL、Cathepsin這2種酶的編碼基因的mRNA水平變化趨勢一致，都是先升后降；PME則前期出現一個快速下降的趨勢；Papain的表達水平為先升高再降低；POD相對表達量在處理28 d前與Papain相對表達

量變化趨勢相似，但在處理28 d后則迅速升高。

2.5 PL編碼基因的相對表達量

本試驗通過qPCR檢測PL基因的mRNA相對表達量，結果發現，PL在所有天麻樣品中都有表達，經過茶多酚涂膜的樣品，其PL的相對表達量明顯低于空白組；用超高壓處理的天麻樣品，在處理14 d時PL的表達量顯著低于空白組，但是隨著保鮮時間的增加，PL的相對表達量明顯升高；用茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品，在處理14 d時的表達量極顯著高于空白對照組，并且隨著保鮮時間的增加，其表達量迅速降低(處理21 d左右)，之后有所上升，但表達水平的變化差異不明顯(表2)。

表2 PL的mRNA相對表達量

2.6 PME編碼基因的相對表達量

果膠甲酯酶可以降解植物細胞壁中的果膠，在植物中普遍表達。在處理時間為14 d時，茶多酚涂膜的天麻樣品中PME的表達量低于空白對照組，而在處理時間超過35 d后則高于空白對照組；經茶多酚涂膜+超高壓處理的樣品在處理前21 d均低于空白對照組，在處理35 d時略有升高；超高壓處理樣品PME的相對表達量表現為先升高后降低的趨勢(表3)。

表3 PME的mRNA相對表達量

2.7 POD編碼基因的相對表達量

過氧化物酶具有抗氧化性，經qRCR檢測發現，處理14 d時，3種不同處理方式的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達量均低于空白對照組，但在處理21 d時，經超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達量極顯著高于空白對照組，其他2種則與空白組差異不大；在處理28 d時，天麻樣品中POD編碼基因的相對表達量均高于空白組，且茶多酚涂膜的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達量提高了20倍；在處理35 d時，茶多酚涂膜、超高壓處理的天麻樣品中POD編碼基因的相對表達量顯著低于空白對照組，而茶多酚涂膜+超高壓處理的天麻樣品中POD的相對表達量與空白組略接近(表4)。

表4 POD的mRNA相對表達量

2.8 Papain編碼基因

為了分析Papain在天麻軟化過程中的表達情況，用qPCR檢測Papain編碼基因的表達水平。由表5可以看出，茶多酚涂膜處理的天麻樣品的Papain編碼基因相對表達量在處理前28 d均低于空白組，但在處理35 d后則略高于空白組；在超高壓處理下，天麻樣品的Papain編碼基因的相對表達量遠遠高于空白對照組，在處理35 d時提高到處理7 d時的437倍左右；在茶多酚涂膜+超高壓處理下，天麻樣品的Papain編碼基因相對表達量在處理 14 d 時高于空白對照組，但在處理21 d時迅速降低，隨后又緩慢提高，但都低于對照。

表5 Papain的mRNA相對表達量

2.9 Cathepsin編碼基因的相對表達量

Cathepsin的主要功能是降解蛋白質，經qPCR檢測發現，茶多酚涂膜處理的天麻樣品Cathepsin編碼基因的相對表達量始終低于空白對照組；在超高壓處理下，天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達量先升高后降低，且遠遠高于空白對照組；在茶多酚涂膜+超高壓處理下，天麻樣品的Cathepsin編碼基因的相對表達量在處理14 d時提高到處理7 d時的103倍，在處理21 d時提高至處理7 d時的8倍；在處理35 d時上升到處理7 d時的232倍(表6)。

表6 不同處理時間Cathepsin的mRNA相對表達量

3 討論

近年來，關于天麻保鮮的研究主要集中在生理生化指標測定方面，隨著科學技術的發展，相關研究正逐步向生物技術靠攏。大量研究發現，果蔬的軟化與細胞壁有密切關系，植物細胞壁的主要成分為纖維素、果膠，而高等植物細胞壁中果膠含量較高，是植物細胞間質的重要成分，因此，與植物細胞壁有關的酶與天麻的軟化程度密切相關。目前關于天麻軟化相關酶的報道較少，本試驗選取與天麻同科或同屬植物軟化相關酶的基因序列，用BLAST進行序列比對，選取高度保守的序列，用Primer 5.0工具，每個基因設計2～3對引物，共設計22對引物，經過普通PCR擴增篩選及qPCR篩選，最終選取PL、PME、Papain、POD和Cathepsin等5種軟化酶進行分析，分別在3種不同包裝方式的天麻樣品中檢測了上述軟化酶的表達差異。在天麻軟化過程中，這5個基因的mRNA表達水平均受到影響，果膠裂解酶在經茶多酚涂膜后表達量顯著降低，說明這種處理方式抑制了PL的表達，保鮮效果較好；而在經過3種不同包裝方式處理后，PME的表達水平變化以顯著為主，說明PME的表達可能不受這3種包裝方式的影響；經3種不同方式處理的天麻樣品貯藏35 d時POD的相對表達量均低于空白組，說明POD減緩了天麻的氧化程度，具有較好的保鮮效果；經超高壓處理后，Papain的相對表達量升高，說明經過這種方式促進了Papain的表達，天麻軟化程度加深，但經過茶多酚涂膜+超高壓處理后的天麻Papain的相對表達量比超高壓處理的天麻的表達量低，進一步說明茶多酚涂膜的保鮮效果較好；茶多酚涂膜的天麻樣品種組織蛋白酶的相對表達量始終低于空白組，而其他處理方式的Cathepsin相對表達量升高，說明茶多酚涂膜有利于天麻的保鮮。綜上所述，茶多酚對天麻保鮮的效果較好，而超高壓處理反而促進了天麻的軟化，推測可能是超高壓處理時的溫度、壓強和處理時間不佳造成的；在分子水平上，天麻軟化過程是由多個基因共同調控的，而本試驗僅選取且研究了一小部分基因，不能夠完全展現天麻在保鮮過程中的軟化調控機制，天麻的軟化相關基因的調控機制還需進一步探索，本試驗的結果可為進一步的研究奠定基礎，為天麻保鮮研究提供參考。