呋喃唑酮代謝物人工抗原的制備與鑒定

吳 萌， 吳海濤， 圣志存， 陳曉蘭， 蘇棪華， 柳青青

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300)

呋喃唑酮(furazolidone)，學名3-(5-硝基糠醛縮氨基)-2-唑烷酮，又名痢特靈，屬于硝基呋喃類藥物，具有廣譜的抗菌作用；現代藥理毒理試驗研究表明，呋喃唑酮在機體內代謝周期短、易衰減，主要代謝物為3-氨基-2-唑酮(AOZ)，分子結構式，結果見圖1-A，AOZ可與機體內組織蛋白緊密結合，從而殘留數周，對人體具有潛在的致癌、致突變作用。因此，我國相關法規明確規定嚴禁動物性食品中添加包括呋喃唑酮在內的硝基呋喃類藥物。但在實際生產中，由于呋喃唑酮預防和治療細菌性感染效果顯著且價格低廉，所以仍存在非法使用的情況。因此，建立快速、簡便的檢測方法自然尤為重要。由于呋喃唑酮衰減原因，研究者們大多以AOZ作為標志物檢測呋喃唑酮是否非法使用。

目前，檢測呋喃唑酮代謝物AOZ殘留常用的方法為液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)，具有檢測靈敏度高、結果準確性好等優點，但存在前樣處理復雜、檢測時間長、成本昂貴等問題，尤其不適合大批量樣品的快速篩查。免疫分析法因靈敏度高、特異性強、簡便、樣品高通量及成本低等優點也成為檢測呋喃唑酮代謝物的一種重要手段，其建立的關鍵是獲得免疫學特性優良的抗體，而抗體獲得的前提條件為制備待測物的免疫原。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗于2020年12月于江蘇農牧科技職業學院生物制藥技術實驗室完成。SPF級BALB/c小鼠(6周齡，雌性)，購自揚州大學比較醫學中心。

1.2 試劑及儀器設備

2-NP-AOZ：純度≥99.9%，壇墨質檢科技股份有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)：純度≥98%；雞卵清白蛋白(OVA)：純度≥98%，默克集團(Merck)；BCA蛋白定量試劑盒、明膠封閉緩沖液、ELISA顯色液與終止液、HRP-羊抗小鼠二抗：生工生物工程(上海)股份有限公司；1×PBS(pH值7.2～7.4)緩沖液、1×PBST緩沖液(pH值7.2～7.4)：北京索寶來科技有限公司；乙腈、亞硝酸鈉：均為AR，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

DK-S11數顯水浴鍋，上海浦東榮豐科學儀器有限公司；4800 Plus MALDI-TOF/TOF質譜儀，AB SCIEX 公司；3500BR全自動凝膠成像分析系統，上海天能科技有限公司；VE180垂直電泳儀，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 完全抗原的合成 采用重氮法合成呋喃唑酮代謝物AOZ的完全抗原，包括免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA。準確稱取AOZ衍生物(2-NP-AOZ)5 mg，溶解于500 μL乙腈中，加入2 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，攪拌，再加入2 mg鋅粉，振蕩混勻；水浴中加熱 20 min，取上清冷卻至4 ℃，獲得2-NP-AOZ還原液。1 mol/L鹽酸調節還原液pH值至1.0～2.0，加入2 mol/L亞硝酸鈉溶液，至淀粉碘化鉀試紙檢驗呈灰藍色。將上述混合液逐滴加至1 mL含50 mg的0.01 mol/L BSA且pH值為7.4的PBS溶液中，攪拌，調節pH值至8.5，避光條件下振蕩1 h，放置在4 ℃冰箱過夜。PBS透析4 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清，即為免疫原2-NP-AOZ-BSA。包被原2-NP-AOZ-OVA的制備方法同上，以OVA代替BSA。

1.3.2 完全抗原濃度的測定 采用BCA試劑盒法測定人工抗原的濃度。將試劑盒中BSA標準品溶液(5 mg/mL)以PBS稀釋成0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL，分別取稀釋好的BSA標準品和待測人工抗原各20 μL置于96孔板中，加入200 μL/孔 BCA工作液，混勻；37 ℃ 水浴保溫30 min。冷卻至室溫后，在酶標儀中測定各孔的值。以標準組各管平均值為縱坐標，對應的蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算待測人工抗原的濃度。

1.3.3 紫外掃描光譜鑒定合成的完全抗原 將2-NP-AOZ-BSA 和2-NP-AOZ-OVA稀釋至0.5 mg/mL，以BSA、OVA、2-NP-AOZ標準品溶液作為對照，在200～400 nm范圍內對上述溶液進行紫外光譜掃描，記錄圖譜，根據人工抗原與2-NP-AOZ標準品和載體蛋白BSA(OVA)吸收峰的變化判斷偶聯效果。

1.3.4 SDS-PAGE鑒定合成的完全抗原 將待測品BSA、OVA、2-NP-AOZ-BSA與2-NP-AOZ-OVA均配制為0.5 mg/mL溶液，分別與5×SDS Loading Buffer按照5 ∶1體積比混合，煮沸 10 min。取煮沸后待測樣各20 μL加入上樣孔，經10%分離膠分離；電泳結束后以考馬斯亮藍染色液染色1 h后，脫色，至蛋白條帶清晰無雜色。根據條帶位置即蛋白泳動速度判斷偶聯是否成功。

1.3.5 MALDI-TOF-MS鑒定合成的完全抗原 將2-NP-AOZ-BSA和2-NP-AOZ-OVA稀釋至1 mg/mL，經脫鹽處理后分別與基質溶液混合，BSA和OVA溶液作為對照。點靶，置于質譜儀內進行激光掃描，獲取離子質譜圖，根據樣品相對分子量判斷是否偶聯成功并計算偶聯比。偶聯比=(-)/，其中：表示相對分子質量。

1.3.6 動物免疫 選6只6周齡雌性SPF級BALB/c小鼠，4只以2-NP-AOZ-BSA為免疫原免疫；1只為空白對照，以PBS為免疫原免疫；1只為陰性對照，相同的條件下飼養。首次免疫時加入等量的弗氏完全佐劑混合，以50 μg/只多點皮下注射。第2、第3、第4次免疫時用等量的弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑與免疫原混勻；第5次免疫時不添加7 d后采血，37 ℃放置2 h后置于4 ℃過夜，3 000 r/min 離心10 min，收集上清，-20 ℃保存。

1.3.7 免疫血清效價的測定 采用間接ELISA測定血清效價。將包被原2-NP-AOZ-OVA稀釋至2.5 μg/mL，以100 μL/孔包被于96孔ELISA板上，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，3次后加入 250 μL/孔 1%明膠封閉液，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，3次后加入倍比稀釋的多抗血清100 μL/孔，并設置陰性、空白對照，37 ℃孵育2 h；PBST洗板，3次后加入稀釋好的羊抗鼠酶標二抗100 μL/孔，37 ℃ 孵育1.5 h；PBST洗板后，加入100 μL/孔 TMB顯色液，避光反應10 min后加入終止液，50 μL/孔。酶標儀上選定空白對照后，測定值，待測孔為，陰性對照為，當≥02且≥2.1 時，判定為陽性。

1.3.8 免疫血清敏感性的測定 采用間接競爭ELISA測定AOZ免疫血清的敏感性。將2-NP-AOZ-OVA包被至ELISA板上，加入50 μL/孔不同質量濃度的2-NP-AOZ標準品(1 000.000、500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625、7.813、3.906、1.953、0.000 ng/mL)和 50 μL/孔為1.0對應稀釋倍數的多抗血清；最后一孔只添加50 μL的PBS，設置為空白對照。其他步驟見“1.3.7”節。以(代表不同質量濃度 2-NP-AOZ標準品孔的，代表2-NP-AOZ標準品質量濃度為0時的)為縱坐標，以2-NP-AOZ標準品質量濃度對數為橫坐標繪制抑制曲線，計算AOZ多抗的半數抑制濃度IC，并通過IC判斷抗體的敏感性。

2 結果與分析

2.1 完全抗原濃度的測定

由圖2可知，線性回歸方程式為=0912 4+0110 4，=0.996 1，計算人工抗原2-NP-AOZ-BSA濃度為4.9 mg/mL，2-NP-AOZ-OVA濃度為5.2 mg/mL。

2.2 完全抗原的紫外光譜掃描測定

由圖3-A可知，BSA在279 nm左右有最大吸收峰，2-NP-AOZ-BSA的特征性吸收峰相比BSA有一定程度的偏移，且與2-NP-AOZ的紫外光譜圖和趨勢不同，初步判斷2-NP-AOZ與BSA偶聯成功。

由圖3-B可知，2-NP-AOZ-OVA的紫光吸收曲線較OVA與2-NP-AOZ均發生明顯變化，初步判斷2-NP-AOZ與OVA偶聯成功。

2.3 完全抗原的SDS-PAGE鑒定

由圖4可知，相同條件下2-NP-AOZ-BSA的遷移速率小于BSA，2-NP-AOZ-OVA的遷移速率小于OVA，均出現了明顯的拖尾現象。說明2-NP-AOZ-BSA分子量明顯大于BSA，2-NP-AOZ-OVA分子量明顯大于OVA，推測BSA、OVA均成功偶聯了部分2-NP-AOZ，可初步判定免疫原與包被原合成成功。

2.4 完全抗原的MALDI-TOF-MS分析

由圖5可知，人工抗原2-NP-AOZ-BSA與 2-NP-AOZ-OVA相對分子量較載體蛋白相對分子量明顯增大，與SDS-PAGE顯示人工抗原比載體蛋白泳動速度慢的結果一致，表明偶聯成功。由圖5-A可知，2-NP-AOZ-BSA的相對分子量為67 892.54，BSA的相對分子量為66 228.92；由圖 5-B 可知，2-NP-AOZ-OVA的相對分子量為 45 383.69，OVA的相對分子量為 44 484.31，根據 2-NP-AOZ相對分子量大小，得出2-NP-AOZ與BSA的偶聯比為7.1 ∶1，2-NP-AOZ與OVA的偶聯比為3.8 ∶1。

2.5 免疫血清效價的測定

由表1、表2可知，4只以2-NP-AOZ-BSA為免疫原進行免疫的小鼠經3次免疫后血清效價均達1 ∶16 000及以上；經5次免疫后血清效價均達 1 ∶32 000 及以上。以2-NP-AOZ-OVA為包被原檢測小鼠血清，避免了血清中針對載體蛋白的抗原-抗體特異性反應，表明以合成的免疫原免疫小鼠后產生了針對2-NP-AOZ的抗體，且隨著免疫次數增加，人工抗原免疫效果增強。

表1 3次免疫后小鼠血清效價測定結果

表2 5次免疫后小鼠血清效價測定結果

2.6 免疫血清敏感性的測定

以1號小鼠免疫血清為例，通過間接競爭ELISA測定免疫血清的敏感性。由圖6可知，2-NP-AOZ對小鼠免疫血清有抑制作用，其線性回歸方程式為=-0254+0890 3，為0.986 5，IC為34.43 ng/mL。免疫血清敏感性鑒定結果說明，2-NP-AOZ與載體蛋白成功偶聯，合成了免疫原性良好的人工抗原，該抗原能有效刺激機體產生特異性免疫應答，可產生敏感性較好的抗2-NP-AOZ的血清。

3 討論

免疫學認為相對分子量小于1 000 u的分子僅具備反應原性，無免疫原性。呋喃唑酮代謝物(AOZ)分子量為102，為典型小分子物質，因此不能刺激機體產生免疫應答，必須與大分子物質如蛋白質載體偶聯，形成完全抗原后才具有免疫原性。本研究前期曾嘗試以AOZ直接連接載體蛋白BSA來生產制備抗體，但效果不理想，這與李敏等的結果一致；原因可能是AOZ分子量太小，直接偶聯載體蛋白會被蛋白質分子包裹，不能形成有效的抗原表位，導致產生的抗體免疫學特性較差，通常以AOZ衍生物(即在AOZ上連接1個間隔臂)代替AOZ合成人工抗原。相關研究表明，免疫效果與間隔臂有關，間隔臂長度為3～6個碳為宜；除此之外，具有苯環的半抗原分子制備抗體的成功率為30%，而不含苯環則成功率僅為9%。溫丹華等選擇AOZ衍生物CP-AOZ合成人工抗原，制備抗體，建立免疫學檢測方法，與前人研究常用的AOZ衍生物不同，本研究選擇了同樣具有苯環的AOZ衍生物2-NP-AOZ合成人工抗原，原因是后期建立AOZ免疫學檢測方法時需要將檢測樣品衍生化，常得到的衍生化產物為2-NP-AOZ，且市面上有2-NP-AOZ的標準品而無CP-AOZ的標準品。

小分子與蛋白質是否偶聯成功可用多種方法鑒定，如紫外吸收光譜法、紅外吸收光譜法、SDS-PAGE、核磁共振氫譜、質譜等。由于2-NP-AOZ中含有可還原硝基，本研究采用重氮法分別與BSA和OVA偶聯獲得免疫原和反應原；先通過SDS-PAGE判定偶聯效果，結果顯示，偶聯物的泳動速度小于載體蛋白的泳動速度，初步證明偶聯成功。然后通過MALDI-TOF-MS分析分子偶聯物和載體蛋白的分子量差別，判斷偶聯成功。Erlange研究發現，偶聯率3～25 ∶1比較合適；但也有學者認為半抗原與載體蛋白的偶聯比對誘導抗體產生無決定性影響。本研究采用MALDI-TOF-MS分析法根據相對分子量差異計算偶聯比，簡單快速且結果準確，得出 2-NP-AOZ與BSA偶聯比為 7.1 ∶1，與OVA偶聯比為3.8 ∶1，均在適宜范圍內。

半抗原與載體蛋白反應合成的人工抗原，雖然從其分子結果已經證明偶聯成功，但合成的免疫抗原是否具有免疫原性，最終必須通過免疫學試驗來檢驗。本研究以2-NP-AOZ-BSA為免疫原免疫小鼠，3次免疫后血清效價均達1 ∶16 000及以上，5次免疫后血清效價均達1 ∶32 000及以上，說明人工合成的抗原能有效刺激機體產生免疫反應，具有良好的免疫原性，且免疫次數增多，免疫效果增強。

4 結論

本研究以AOZ的衍生物2-NP-AOZ分別偶聯BSA和OVA，制備免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA，經紫外光譜掃描、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析初步判斷偶聯成功，偶聯率分別為7.1 ∶1和3.8 ∶1。將免疫原以50 μg/只免疫小鼠，3次和5次免疫后小鼠血清效價達1 ∶16 000及以上和1 ∶32 000及以上，合成的人工抗原具有良好的免疫原性。本研究完成了AOZ人工抗原的合成，為AOZ單克隆抗體的制備和免疫學檢測方法的建立奠定了基礎。