小麥全蝕病拮抗細菌Z0-j的鑒定及其生防潛力評估

李正鵬， 蘇皖平， 楊 威， 宋虎衛， 顧大路， 劉廷武， 羅玉明

(1.江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室/淮陰師范學院生命科學學院，江蘇淮安 223300；2.江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所，江蘇淮安 223001)

由禾頂囊殼小麥變種(var.)引起的小麥全蝕病，是世界上最重要的小麥根部病害，因其突出的土壤傳播特性，一直是小麥亟待解決的防治難題。該病在我國安徽省、山東省和河南省等栽培地區廣泛發生，目前主要采取化學藥劑拌種的方法進行防治，而化學防治易引起環境污染及產生抗藥性。隨著人們環保、綠色意識的增強，利用微生物防控全蝕病已成為一條行之有效的新途徑。假單胞菌是廣泛存在于植物根際的一類微生物，常常具備顯著防治植物病害、促進植物生長的作用。其生防機制包括產生拮抗物質和鐵載體或水解酶、營養競爭、生物膜的快速形成以及誘導植物抗性等。因此，本研究在前期構建的微生物資源庫基礎上，以禾頂囊殼小麥變種為靶標菌，鑒定全蝕病生防菌株Z0-j，并對其拮抗效果和代謝產物穩定性進行評估，為進一步開發利用奠定理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原真菌為禾頂囊殼小麥變種，由黑龍江八一農墾大學柯希望副教授惠贈。

供試生防細菌Z0-j，2017年11月篩選自江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室有益微生物資源庫，編號L031，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化 靶標菌：將斜面上保存的禾頂囊殼小麥變種擴繁于PDA培養基上，待菌落直徑長至培養皿的一半時，待用。

菌株Z0-j發酵液制備：按照前期研究結果，將直徑7 mm的菌餅接種到種子發酵培養液(250 mL 三角瓶，發酵培養基裝瓶量為50 mL)中，于28 ℃、150 r/min搖床上培養2 d后，以12.8%的接種量、裝料量100 mL/250 mL，接入NA發酵培養液中進行二次發酵，于25 ℃、120 r/min搖床上培養2 d，即為發酵液原液。將發酵液原液在10 000 r/min、4 ℃下離心15 min，上清液經0. 22 μm無菌濾膜過濾，即為無菌發酵濾液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 16S rDNA鑒定 采用細菌基因組試劑盒提取基因組DNA，用細菌通用引物27F (5′-A G A G T T T G A T C M T G G C T C A G-3′)和1492R (5′-G G T T A C C T T G T T A C G A C T T-3′) 進行16S rDNA的PCR擴增。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30次循環；最后 72 ℃ 延伸10 min。所得PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序后的序列，利用 Genbank 中的 BLAST 軟件對獲得的 16S rDNA 序列進行同源性分析，再通過 MegaX 軟件構建系統進化樹。

1.2.3 菌株Z0-j抑菌效果測定 采用菌絲體干質量法測定菌株Z0-j對小麥全蝕病菌的抑菌效果。將生長72 h的靶標菌菌餅(直徑7 mm)，移至PD培養液中，再將不同體積的生防菌Z0-j發酵液原液和上清液加入搖瓶中，設置無菌水作為對照，每個處理重復3次，于25 ℃、110 r/min條件下培養，4 d后取菌絲于30 ℃條件下烘干，測定菌絲干質量，并計算抑制效果。

1.2.4 菌株Z0-j抑菌效果的顯微觀察 利用皿內對峙法，取受抑制后的靶標菌菌落邊緣菌絲，利用光學顯微鏡進行形態學觀察，并以照片記錄受抑制菌絲形態變化。

1.2.5 菌株Z0-j對靶標菌菌絲膜通透性的影響 采用電導率法進行測定，參考郅曉燕等的方法，稍作改動。將靶標菌菌餅接種于PD液體培養基中，于25 ℃、110 r/min振蕩培養3 d后，將菌絲用蒸餾水沖洗3次，去除菌絲表面培養基及水分；分別稱取0.1 g菌絲體，加入到設置不同濃度菌株 Z0-j 發酵液的水溶液中，以蒸餾水作為空白對照。在20 ℃條件下分別測定0、0.5、1、2、4 h時處理和對照溶液的電導率，重復3次。根據公式計算溶液電導率的增幅。

電導率增幅=(不同時刻電導率-初始電導率)/初始電導率×100%。

1.2.6 代謝產物穩定性分析 溫度影響：無菌發酵液置于恒溫水浴鍋中處理30 min，梯度為40、60、80、100 ℃，采用皿內對峙法測定其抑菌效果。

pH值影響：用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH調節發酵上清液pH值分別為4、6、7、8、10、12，處理后放入 4 ℃冰箱中放置48 h，采用皿內對峙法測定其抑菌效果。

紫外線影響：100 W紫外燈下處理無菌發酵濾液0～1 h，梯度間隔為10 min，距離為60 cm，再采用皿內對峙法測定其抑菌效果。

超聲波影響：利用100 W超聲波分別處理無菌發酵上清液20、30、40、60 min，采用皿內對峙法測定其抑菌效果。

蛋白酶K影響：吸取1 mL無菌發酵上清液于1.5 mL離心管中，向管內加入濃度不同的蛋白酶K，使其終濃度分別達到2、20、100 g/mL，37 ℃下水浴2 h后，采用皿內對峙法測定其抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 菌株Z0-j分子鑒定

將拮抗菌Z0-j測序獲得的16S rDNA序列在Genbank數據庫中進行同源性比對，挑選與之高度同源的序列，然后利用MegaX軟件，利用鄰接法(neighor-joining)構建系統發育樹(圖1)。可以看出，生防菌Z0-j與銅綠假單胞菌() RTE4在同一分支，同源性最高。再結合前期形態學特征與生理生化特征，最終鑒定為銅綠假單胞菌。

2.2 抑菌效果測定

菌株Z0-j對小麥全蝕菌()菌絲生長抑制72 h后，進行菌絲干質量測定。從圖2可以看出，處理組L50、L100的菌絲干質量與CK存在顯著差異(<0.05)，抑菌效果分別為73.3%、87.4%，且干質量平均值呈下降趨勢；處理Y10、Y50、Y100的菌絲干質量與CK存在顯著差異，抑菌效果均在94%以上，且干質量平均值也呈下降趨勢。由此可見，發酵液中活性物質能夠顯著抑制菌絲的生長，且活性物質含量越高，拮抗效果越好。

2.3 菌株Z0-j對靶標菌抑制顯微觀察

顯微觀察結果(圖3)表明，對照菌絲光滑、纖細、粗細均勻、向前生長；而經生防菌Z0-j處理 72 h 后，靶標菌菌絲多數呈現畸形、粗細不一、頂端膨大、旋轉扭結；部分菌絲明顯出現溶解、斷裂、原生質外滲且透明等雜亂現象。

2.4 菌株Z0-j對靶標菌菌絲膜通透性的影響

由圖4可知，隨著處理時間的增加，對照組和處理組溶液的電導率持續增大，處理組電導率增幅明顯高于對照組，且隨著發酵液活性物質濃度增多，處理組溶液電導率增幅也呈增大趨勢。當添加 100 μL 發酵上清液時，處理后溶液的電導率平均增幅在120 min時為18.25%，當添加100 μL發酵原液時，處理后溶液的電導率平均增幅在120 min時為21.14%。由此可知，菌株Z0-j可以破壞靶標菌菌絲完整性，和顯微觀察結果一致。

2.5 不同外界因素對代謝產物穩定性的影響

2.5.1 溫度對活性物質穩定性的影響 用平板對峙法測量20(CK)、40、60、80、100 ℃與室溫下的活性物質抑菌效果，結果顯示，發酵濾液的抑菌圈直徑總體呈縮小趨勢。CK與其他溫度處理相比差異顯著；高于40 ℃處理的抑菌圈直徑顯著縮小；但在100 ℃條件下活性物質仍有較強抑菌活性，抑菌圈直徑達到26.58 mm，說明活性物質在高溫處理下比較穩定(圖5)。

2.5.2 pH值對活性物質的影響 用平板對峙法測量生防菌Z0-j活性物質在pH值為4、6、7(CK)、8、10、12時的抑菌活性，發現隨著pH值變化，活性物質的抑菌作用在酸性條件下差異不顯著，在堿性條件下顯著下降，但仍表現出較強的抑菌活性，表明菌株Z0-j可能含有多種活性物質，保證抑菌能力對不同pH值條件的穩定性(圖6)。

2.5.3 紫外線對活性物質的影響 由圖7可知，經不同時間(10、20、30、40、50、60 min)紫外線處理后，Z0-j發酵濾液的抑菌作用出現了顯著差異。未經紫外線照射處理的發酵濾液的抑菌作用最大，抑菌圈直徑為29.76 mm，紫外線照射處理后，抑菌圈直徑有所縮小，但從照射時長在20 min以上后，仍保持有27.82 mm的抑菌圈直徑，且各處理間沒有顯著差異。說明發酵液活性性物在紫外線條件下抑菌作用比較穩定。

2.5.4 超聲波對活性物質的影響 由圖8可知，隨著超聲波處理時間(20、30、40、60 min)的延長，未經處理的發酵濾液抑菌圈直徑為29.03 mm，處理的抑菌圈對比對照顯著縮小，但至少仍有27.62 mm的直徑，且各個處理間無顯著差異。說明該活性物質對超聲波有較好的耐受性。

2.5.5 蛋白酶對活性物質的影響 用平板對峙法測量了生防菌Z0-j活性物質經蛋白酶K處理后的抑菌圈直徑，發現各處理的活性物質的抑菌圈直徑逐漸減小，存在顯著差異。蛋白酶K濃度為2 g/L處理時，抑菌效果與對照之間無顯著差異：蛋白酶K濃度逐漸提高到20 、100 g/L時，抑菌能力顯著降低，但抑菌圈直徑仍有25.70 mm。由此可見，活性物質中可能含有某些酶類物質，但發酵液活性物質整體對蛋白酶K表現出良好的耐受性(圖9)。

3 討論與結論

小麥全蝕病是小麥生產過程中的重大病害，本研究鑒定和評估了內生細菌Z0-j及其對小麥全蝕病菌的生防潛力，證明了內生細菌Z0-j為銅綠假單胞菌()，對靶小麥全蝕病菌拮抗效果顯著，能夠引致靶標菌菌絲畸形、頂端膨大、原生質外滲、細胞膜透性增強，甚至菌絲死亡。同時，菌株Z0-j活性物質對溫度、pH值、紫外光照、超聲波以及蛋白酶等外界因素有良好的耐受性，表明內生細菌Z0-j是一株對小麥全蝕病具備良好開發潛力的生防菌株。

研究表明，活躍在植物根際的假單胞菌一方面產生活性物質或改善礦質營養直接促進植物生長，另一方面產生代謝物質或競爭作用抑制或阻礙病原微生物的侵染。假單胞菌產生的鐵載體通過競爭病原菌的鐵營養而占據優勢生態位，拮抗物質如吩嗪酸(PCA)、硝吡咯菌素(Prn)、2，4-二乙酰滕黃酚(Ph1)、藤黃綠膿菌素(Plt)、環狀脂多肽等通過抑制孢子萌發、裂解真菌菌絲等途徑抑制病原真菌生長發育，多種低分子量揮發性有機化合物(VOCs)亦抑制菌絲生長、產孢、萌發等，水解酶如幾丁質酶、蛋白酶和纖維素酶可以溶解真菌的細胞壁，甚至一些吩嗪類和VOCs物質還參與植物系統抗性的誘導。本研究中的生防假單胞菌Z0-j能夠顯著抑制靶標菌小麥全蝕菌()的生長，在不同影響因素條件下表現的抑制效果有所差異，證明活性物質中有多種抑菌物質，且包含一些能被蛋白酶K影響的酶類活性物質。

一直以來，生防假單胞菌被認為是一種有效、環保、可持續的化學殺菌劑替代品。然而，對于成千上萬被報道的潛在生防資源而言，僅有極少數被開發應用，其主要原因就是野外條件下生物資源的穩定性不佳，進而影響其商業化程度。因此，生防菌活性物質的穩定性是其作為生防制劑、生物肥料、植物生長調節因子等發揮有效作用的關鍵因素。本研究中生防假單胞菌Z0-j發酵液中的活性物質在溫度、pH值、紫外線、超聲波、蛋白酶K等影響下，依然表現出良好的抑菌能力，顯示出對外界環境的耐受性，說明該菌株是一株對小麥全蝕病有開發潛力的生防菌株。