硒、硅對鎘脅迫下小麥生長、生理特性及鎘分布的影響

張明輝， 時曼麗

(南陽市農業科學院，河南南陽 473000)

鎘(Cd)是一種劇毒性化學元素，存在于水體和土壤環境介質中。人類活動，包括金屬采礦和冶煉、廢水灌溉、磷肥施用等是環境Cd污染的主要來源，人類行為產生的Cd含量比與地質自然Cd含量高出3～10倍。Cd是流動性較快的重金屬元素之一，并且在水-土壤-植物系統中具有較高的活性；農業生產中向土壤施入Cd是一種凈匯過程，這意味著一旦Cd進入到環境介質中，很容易在植物中積累，嚴重影響植物生長和作物產量，然后通過食物鏈進入動物體，對人體肝臟、生殖器、心血管、內分泌以及肝臟系統造成損害，從而對環境和人類健康造成不利影響。因此，在農業生產中限制Cd從土壤轉移到植物對于食品安全至關重要。

目前，已探索了一系列農藝措施、生物技術及土壤鈍化技術來管理和修復Cd污染土壤并控制其在作物中的積累。研究發現，為植物提供有益元素是減少小麥Cd積累和毒性的最具成本效益、環境友好的可持續策略之一。硅(Si)和硒(Se)是廣受關注的重要有益元素，大量研究表明，Si、Se對生長發育、產量收獲和抵抗各種生物/非生物脅迫皆具有較佳的作用效果。研究表明，Si可以有效減輕不同作物的重金屬毒性，如玉米、小麥和水稻。在Cd脅迫下，Si可以調節負責Cd從外部溶液轉運到水稻植物根部細胞的相關基因轉錄水平，從而抑制Cd吸收。在細胞中，Si與半纖維素結合具有凈負電荷可抑制Cd吸收，使其在細胞壁上形成共沉積。Cd受到HMA基因家族表達的調節，促進液泡中的Cd分離，以減輕Cd在植物中遷移和運輸過程中的毒性。Se是動物必需的營養元素，也是植物的有益營養元素，Se主要通過防止氧化應激，調節光利用率，修復細胞損傷和調節基因表達來降低Cd毒性。

Si和Se的比較研究在研究人員中也越來越受到關注。 Wu等的研究表明，在卷心菜植株中同時噴灑5 μmol/L Si和Se可顯著降低卷心菜的根系和地上部中的Cd含量。然而，關于這些必需微量元素的相互作用及其對緩解Cd毒性影響的認識仍然有限。小麥是全球30%以上人口的主要食物，小麥中的高Cd積累導致過量的Cd攝入從而對人類健康造成巨大威脅；因此，減少小麥從土壤中吸收Cd是一個至關重要的糧食安全環節。基于此，本研究探索了Se和Si相互作用對小麥發育代謝、抗氧化系統、Cd累積分布及相關基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗于2021年2—5月在南陽市農業科學院進行。供試小麥品種為鄭麥1354，種子來自河南省農業科學院經濟作物研究所。種子采用0.5%次氯酸鈉進行表面滅菌15 min，然后用去離子水沖洗數次并浸泡12 h，然后放置于鋪墊潤濕濾紙的培養皿中，28 ℃培養箱暗處理催芽24 h。

供試鎘為氯化鎘(CdCl)，硒為五水亞硒酸鈉(NaSeO·5HO)，硅為九水偏硅酸鈉(NaSiO·9HO)，均購自國藥集團。

供試土壤取自河南省南陽市農業科學附近原始土，土壤類型為中性沙壤土。土壤經風干后混勻過 3 mm 網篩，土壤pH值為7.11，土壤有機質含量10.06 g/kg，全氮含量0.85 g/kg，堿解氮含量 42.80 mg/kg，有效磷含量12.23 mg/kg，速效鉀含量75.29 mg/kg，全鎘含量0.04 mg/kg，根據GB 15618—2018《農用地土壤污染土壤環境質量風險控制標準》，當土壤6.5

1.2 試驗設計

試驗設置5個處理：CK，不施用鎘、硒、硅；Cd處理：僅施用鎘，不施用硒、硅；Cd+Si處理：施用鎘、硅，不施用硒；Cd+Se處理：施用鎘、硒，不施用硅；Cd+Si+Se處理：施用鎘、硒、硅。各處理重復4次。其中Cd用量為15 mg/kg，Si、Se單一元素用量皆為4 mg/kg。

盆栽裝置為黑色方形塑料盒(20 cm×15 cm×15 cm)，每盆裝土2.5 kg。Cd、Se、Si皆采用水溶方式提前施入。每盆施入小麥種子20粒，出苗后減至10株。為保證幼苗的正常生長及養分平衡，每周向盒中加入50 mL小麥營養液。共培育35 d，種植期間不定時加入無菌水，其他管理措施同作物培育方法。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 小麥植株生物量、Cd濃度及Cd亞細胞分布測定 培養結束后將小麥植株地上部、根系分開，采用直尺測量根長及株高參數，將植株105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒質量以計算生物量。Cd濃度采用HNO消解，采用電感耦合等離子體光譜儀(ICP-OES)測定樣品中的Cd濃度。

細胞壁(Fcw)、細胞質(Fs)和細胞器(Fo)分級用于確定Cd的亞細胞分布，相關方法參考Xin等的研究并略有修改，即將冷凍小麥植物樣品稱量到冷砂漿中，并用預冷的250 mmol/L蔗糖和1 mmol/L二硫代甲狀腺素醇(DTT)混合緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5)提取樣品。然后將勻漿以7 000 r/min離心30 s，沉淀物即為Fcw，在上清液以15 000 r/min進一步離心45 min后，上清液溶液和沉積物分別鑒定為Fs和Fo。

1.3.2 光合特征參數及葉綠素含量測定 光合色素包含葉綠素a、葉綠素b均采用丙酮-乙醇混合浸提，采用紫外分光光度計(UV-755B，青島聚創華業分析儀器有限公司)在665、649 nm處測定吸光度，具體步驟參照李合生等的研究。采用LI-6400便攜式光合測定系統(LI-6400；LI-COR，America)測定葉片的凈光合速率()、胞間CO濃度()、蒸騰速率()和氣孔導度()等指標，葉室溫度設置為(25±1) ℃，CO濃度為440 μmol/mol，光量子密度為800 μmol/(m·s)。

1.3.3 丙二醛(MDA)、抗壞血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PC)含量的測定 丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法測定，抗壞血酸含量的測定采用2，4-二硝基苯肼比色法。

采用三氯乙酸(DTPA)和5%磺基水楊酸順時針快速研磨獲得粗提物，GSH含量的測定參照韓丹的方法，即抽取0.25 mL上述提取物加入 2.6 mL 150 mmol/L NaHPO(pH值7.7)和 0.18 mL 5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)試劑。采用30 ℃水浴振蕩5min，采用紫外分光光度計在412 nm處測定吸光度，并根據標準曲線計算樣品的GSH含量。PC含量測定：將1 mL粗提物與2.2 mL的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 值7.0)和0.3 mL的DTNB試劑混合，隨后在30 ℃水浴振蕩10 min，然后測量412 nm處的吸光度。

1.3.4 Cd轉運蛋白基因表達水平測定 采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)對小麥根系進行總RNA提取，使用DNaseI-Verso cDNA合成試劑盒將RNA反轉構建cDNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit從總RNA合成第一鏈cDNA。實時PCR采用SYBR Premix ExⅡ 與 7500快速實時PCR序列檢測系統上進行。以為看家基因，相關Cd轉運蛋白基因的引物序列見表1。熱曲線程序：90 ℃30 s，95 ℃15 s，60 ℃30 s和72 ℃30 s，共40個循環。繪制熔解曲線進行分析和瓊脂糖凝膠電泳以保證擴增子。具體反應體系、反應程序步驟見Zhou等的研究，采用2-ΔΔ斷層掃描方法計算目標基因的相對轉錄豐度。

表1 Cd轉運蛋白相關基因的qRT-PCR 引物序列信息

1.4 數據處理與統計分析

采用Microsoft excel 2013進行數據整理，采用IBM SPSS 19.0軟件進行試驗數據統計分析(=0.05)，采用Origin 2021進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 硒、硅對鎘脅迫下小麥生長及葉綠素含量的影響

由表2可知，株高和根長中，各處理均表現為Cd處理

表2 硒、硅對鎘脅迫下小麥生長參數及葉綠素含量的影響

2.2 硒、硅對鎘脅迫下小麥光合特征參數的影響

由圖1-A可知，凈光合速率指標中，以CK最高，Cd+Si+Se處理次之，二者無顯著差異，均顯著大于其他3個處理，且Cd、Cd+Si、Cd+Se這3個處理間差異不顯著。由圖1-B可知，胞間CO濃度指標中，以Cd處理最低，CK、Cd+Se處理、Cd+Si處理、Cd+Si+Se處理較Cd處理分別顯著提高173.63%、104.74%、136.80%、153.82%。氣孔導度指標中，CK處理最高，Cd處理、Cd+Se處理、Cd+Si處理、Cd+Si+Se處理較CK分別顯著降低75.34%、64.38%、67.12%、57.53%，同時這4個處理處理間差異不顯著(圖1-C)。蒸騰速率指標中，各處理表現為Cd處理

2.3 硒、硅對鎘脅迫下小麥鎘吸收及轉移的影響

由圖2-A可知，鎘脅迫下，各處理根系的Cd濃度為地上部濃度的7.03～45.08倍，表明鎘脅迫下小麥根系是主要的Cd累積器官。地上部中，以Cd處理濃度最高，為239.61 μg/g，其他處理較其顯著降低34.04%～69.69%；Cd+Si+Se處理的鎘濃度最低，其他處理較其顯著增加112.57%～229.95%。各處理根系鎘濃度規律與地上部相反，Cd+Si+Se處理鎘濃度最高，Cd、Cd+Si、Cd+Se處理較Cd+Si+Se處理顯著降低48.55%、26.33%、53.94%，且Cd+Si處理的濃度顯著高于Cd、Cd+Se處理。鎘轉移系數為地上部濃度與根系濃度之比，因此，在轉移系數中各處理呈Cd+Si+Se處理

2.4 硒、硅對鎘脅迫下小麥鎘亞細胞分布的影響

小麥地上部和根系的細胞被分成細胞壁(Fcw)、細胞質(Fo)和細胞器(Fs)3個亞細胞部分。對亞細胞鎘濃度的分析(圖3-A)表明，各處理地上部的亞細胞鎘總濃度均低于地下部，尤其是Cd+Si+Se處理。地上部中，亞細胞鎘總濃度以CK處理最高，Cd、Cd+Si、Cd+Si+Se處理較CK處理降低67.37%～88.73%；根系中，各處理亞細胞鎘總濃度表現為Cd+Se處理

2.5 硒、硅對鎘脅迫下小麥抗氧化系統指標的影響

由圖4-A可知，各處理地上部的丙二醛含量明顯高于根系，與CK相比，Cd脅迫處理顯著增加了MDA含量，其地上部、根系增幅分別為38.20%、28.43%，在此基礎上添加Si、Se、Si+Se顯著降低了小麥植株地上部和根系的MDA含量，地上部的降幅為64.44%、19.69%、56.85%；根系的降幅為20.74%、18.73%、38.13%。由圖4-B可知，AsA含量指標中，與相應部位的CK相比，Cd處理地上部、根系的AsA含量分別顯著降低34.66%、40.08%，而施用硒、硅單一和組合處理的地上部顯著提高30.01%～45.68%，根系提高8.14%～61.59%。而在GSH含量指標中，各處理的GSH含量與AsA含量的規律趨于一致，即與CK相比，鎘脅迫降低了地上部和根系的GSH含量，施用硒、硅單一及組合處理則增加了地上部和根系的GSH含量(圖4-C)。由圖4-D可知，PC含量指標中，與CK相比，Cd、Cd+Si、Cd+Se、Cd+Si+Se處理的地上部和根系分別顯著降低18.18%～48.27%和65.27%～81.52%；無論地上部還是根系，均以Cd處理的PC含量最低，與Cd處理相比，Cd+Si、Cd+Se、Cd+Si+Se處理的地上部和根系分別顯著提高33.89%、30.54%、58.16%和84.92%、81.16%、87.94%。

2.6 硒、硅對鎘脅迫下小麥鎘轉運基因表達的影響

測定小麥中參與鎘轉運的基因(、、和)的相對表達量，以了解硒和硅緩解小麥耐鎘的分子機制。由圖5-A可知，與CK相比，Cd處理降低了水稻根系中、和的相對表達量，增加了的表達水平；與Cd處理相比，添加Si、Si+Se使的表達水平分別顯著上調118.18%、122.73%。與Cd處理相比，單施Si、Se使的相對表達量分別降低了30.51%、52.54%，而Si+Se處理的相對表達量增加了83.62%，與單施Si、Se相比，Si+Se的表達水平分別顯著增加了164.23% 和286.90%(圖5-B)。此外，與Cd處理相比，Si、Se和Si+Se的添加均顯著抑制了表達，其相對表達量降幅分別為55.17%、64.66%、32.76%(圖5-C)。與其他基因的表達趨勢不同，與Cd處理相比，Si、Se的添加均降低了的相對表達量，而Si+Se處理使該基因相對表達量顯著增加了1.25倍(圖5-D)。

3 結論與討論

土壤Cd濃度超標已成為影響農業安全發展的制約因子，Si、Se是植物生長發育的有益元素，大量研究表明，脅迫環境下Si、Se對作物生理的影響存在積極作用。本研究結果表明，鎘脅迫下，植物株高、根長及干物質累積量受到顯著影響，在此基礎上添加Si、Se可有效緩解上述生長參數，同時在Si與Se結合處理(Cd+Si+Se)下得到進一步促進，其長勢與CK處理大體相當。此外，各處理小麥葉片的凈光合速率、胞間CO濃度、氣孔導度、蒸騰速率和葉綠素含量整體表現為Cd處理

重金屬的亞細胞分布是植物中最主要的重金屬解毒機制之一，植物細胞壁是保護原生質體免受鎘毒害的首道屏障，它可提供羥基或羧基等極性物質與重金屬離子結合，細胞壁上的離子交換位點飽和后，進入細胞的重金屬會被隔離到液泡中，從而降低游離重金屬離子的活性，進一步降低鎘對植物細胞器的干擾。本研究中，在Cd含量較高的根系中，Cd主要集中在細胞壁中，且與細胞器相比，Si處理的鎘在細胞質中的分布比例更小。這與Zhang的研究結論趨于一致，即硅可以通過增加細胞壁中Cd的含量和比例來減少Cd在細胞質中的分布。本研究中，與相應部位的CK相比，添加硒對根系細胞器中的Cd濃度沒有影響，但卻增加了地上部細胞器的濃度和比例；因此，地上部細胞器沉淀重金屬可能是硒減輕小麥根系鎘毒性的主要機制之一。當Si和Se結合使用時，小麥根系Cd濃度最高，轉移系數最低，且與其他處理差異顯著(圖2)；此外，地上部、根系細胞質中的Cd濃度及比例進一步降低，地上部細胞器的Cd含量增加(圖3)。這說明Si和Se的協同作用可以顯著抑制Cd上移，且促進地上部細胞壁螯合Cd。

氧化還原失衡是鎘脅迫的另一個重要毒性表現。丙二醛是脅迫下過氧化反應的產物，會對植物細胞膜造成嚴重破壞；抗壞血酸是緩解細胞高度氧化的重要還原物質，可中和過氧化物質；而谷胱甘肽和植物螯合肽含有硫醇基團(—SH)，在重金屬解毒的螯合和分離過程中起重要作用。本研究中，Cd處理增加了小麥中的MDA含量，這表明Cd存在氧化損傷，在此基礎上Si、Se單一或結合使用均顯著降低了地上部、根系MDA含量(圖4-A)，各處理AsA含量變化趨勢與MDA相反，這意味著Si、Se結合使用可有效調控MDA與AsA的區室化中和作用以減輕Cd毒性。此外，Si、Se單一或結合使用皆增加了GSH和PC含量(圖4-C、圖4-D)，GSH分泌增加可以直接螯合重金屬，且較高的GSH含量會增加PC的產生，進而螯合細胞中的Cd形成PC-Cd復合物，這些復合物通過液泡膜ATP酶轉運至液泡，從而降低細胞質中的Cd濃度。

金屬轉運基因轉錄水平的調控對于調控植物中重金屬的積累和分布至關重要。在小麥植株中，位于根皮和內胚層末端的是吸收Cd的主要轉運蛋白，參與細胞Cd植物內的吸收和Cd運輸，于小麥根細胞的液泡膜，負責將Cd螯合到根液泡中，于細胞質膜上，介導Cd從根系向地上部的轉運。本研究中，Cd處理降低了小麥根系的表達(圖5-A)，添加Si、Se后，的相對表達量增加，與根系中Cd濃度變化趨勢一致(圖2)，同時Cd處理上調了的表達，添加Si、Se后，的相對表達量顯著降低(圖 5-C)，這會導致較少的Cd轉移到地上部，這與小麥地上部的Cd濃度趨勢一致(圖2)。值得注意的是，Si+Se處理后，的相對表達量較單一Si、Se處理發生顯著上調，而地上部Cd濃度和轉運系數顯著降低。此外，Cd處理抑制了和的表達，在此基礎上Si+Se處理的表達水平顯著上調(圖5-B、圖5-D)，這與根中Cd亞細胞分布一致(圖4)。這些發現進一步表明，Si和Se的協同作用可以通過調節和的表達來促進Cd向液泡的轉運，從而降低根系Cd毒性。