甜菜夜蛾U6 snRNA的克隆及其表達穩定性分析

劉志成， 張鈞博， 方 正， 吳慶珊， 翁慶北，2

(1.貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽 550001； 2.黔南民族師范學院，貴州都勻 558000)

在真核生物基因轉錄后加工過程中，核內小RNA(small nuclear RNA，snRNA)通過與剪接體蛋白組裝成主要剪接體(major spliceosome)和次要剪接體(minor spliceosome)，在該過程中發揮著重要的作用。snRNA作為真核生物主要剪接體的重要組分，其結構高度動態，形成主要剪接體的大部分催化核心，通過與其他snRNA、前mRNA底物(pre-mRNA)和超過25個蛋白質伴侶有序的相互作用，保證mRNA剪接過程的順利進行。

研究基因和microRNA(miRNA)在特定條件下的表達是挖掘它們生物學功能的重要手段之一。反轉錄定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR)作為一種常用的基因表達檢測方法也廣泛應用于鑒定各物種miRNA的表達。在RT-qPCR試驗中，為了校正試驗過程中由于RNA質量、反轉錄效率和PCR酶擴增效率等因素造成的試驗誤差，通常使用肌動蛋白基因()、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因()和18S rRNA基因等表達穩定的管家基因作為內參基因。但由于這些基因遠大于miRNA，不適合作為miRNA RT-qPCR檢測的內參基因。已有報道表明，snRNA在不同物種中十分保守，序列較小，且在生物體內各種細胞中的表達水平相對穩定，因而被廣泛用于各物種miRNA RT-qPCR的內參基因。

甜菜夜蛾()屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆蟲，作為一種雜食性害蟲，可危害茄果類、瓜類、綠葉菜類等超過80多種農作物，具有食量大、破壞性強、繁殖速度快等特點，對每年世界各地農業生產造成重大損失。對甜菜夜蛾生長發育機制和病原免疫機制的了解對開發有效的甜菜夜蛾防治措施具有重要意義。近年來，許多研究發現miRNA通過調節靶基因的表達影響昆蟲的生長發育和病毒-宿主相互作用。因此，研究miRNA在甜菜夜蛾生長發育和抗桿狀病毒機制中的作用對該害蟲的防治具有重要意義。目前已報道多種昆蟲miRNA的表達研究中使用snRNA作為內參基因。但迄今，甜菜夜蛾的snRNA序列及其作為內參基因的研究尚未見報道。

本研究從Se301細胞基因組的測序注釋數據中篩選甜菜夜蛾snRNA，克隆其全長序列，并進行系統進化分析。進一步地分析除蟲菊提取物、高溫培養和甜菜夜蛾核型多角體病毒(multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)感染脅迫下snRNA的表達穩定性。本研究旨在為甜菜夜蛾miRNA表達檢測時內參基因的選擇提供了依據，為甜菜夜蛾miRNA功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甜菜夜蛾、Se301細胞與SeMNPV 甜菜夜蛾幼蟲購自河南省濟源白云實業有限公司。甜菜夜蛾細胞系Se301細胞由荷蘭瓦赫寧根大學的Just M. Vlak教授惠贈，SeMNPV-US1(SeMNPV美國加利福尼亞分離株)由美國加州大學Riverside分校的Brian. A. Federici 教授惠贈。

1.1.2 試劑 Grace完全培養基(Gibco)購自于賽默飛世爾科技有限公司。小RNA提取試劑盒(miRNA Kit)購于OMEGA公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒(miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)和miRNA熒光定量PCR試劑盒[miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit (SYBR Green)]購于天根生化科技(北京)有限公司。高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA 聚合酶)和A-T克隆試劑盒(DNA A-Tailing Kit和pMD 18-T Vector Cloning Kit)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。大腸桿菌DH5α感受態購自北京擎科生物科技有限公司。99.8%除蟲菊提取物原藥購自上海易恩化學技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在25 cm細胞培養瓶中接種1.5×10個Se301細胞，加入Grace完全培養基 5 mL，置27 ℃細胞培養箱中培養約5 d，待細胞密集程度約90%時，進行細胞傳代。

1.2.2 小RNA提取與cDNA合成 2020年12月分別取筆者所在實驗室培養的Se301細胞1×10個或甜菜夜蛾幼蟲血淋巴150 μL，按照miRNA提取試劑盒說明書提取細胞或血淋巴的小RNA，微孔紫外分光光度計檢測小RNA濃度和純度后，置于 -80 ℃ 保存。以提取的小RNA為模板，利用miRNA反轉錄試劑盒進行miRNA反轉錄獲得cDNA。

1.2.3 甜菜夜蛾snRNA克隆 根據甜菜夜蛾Se301細胞基因組測序數據(筆者所在實驗室未公開發表)注釋設計甜菜夜蛾snRNA全長序列擴增引物對，-F(G T A C T T G C T T C G G C A G T A C A T A T)和-R(A A A A A T G T G G A A C G C T T C A C G A)。以Se301細胞小RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，RT-PCR 擴增甜菜夜蛾snRNA全長序列，反應體系如下：cDNA 1 μL，-F和-R(10 μmol/L)各0.5 μL，2 × PrimeSTAR Max Premix 10 μL，ddHO補至20 μL。PCR反應程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的DNA片段，連接pMD18-T載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α。經菌落PCR鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 甜菜夜蛾snRNA的多序列比對與系統進化分析 使用MEGA7軟件的Clustal W算法對甜菜夜蛾等不同物種的snRNA進行多序列比對，GeneDoc進行展示。使用MEGA7軟件的最大似然法(Maximum Likelihood Tree)構建系統發育樹，重復抽樣檢測1 000次。

1.2.5 除蟲菊提取物處理對甜菜夜蛾Se301細胞中snRNA表達的影響 鋪1×10個Se301細胞于直徑35 mm的細胞培養皿中，貼壁過夜。加入含除蟲菊提取物終濃度為半數致死濃度(lethal concentration 50，LC)的培養基溶液，孵育24 h，提取細胞小RNA，反轉錄為cDNA。以不含除蟲菊提取物的培養基溶液培養細胞為空白對照，按miRNA熒光定量試劑盒說明書，熒光定量PCR方法分析snRNA表達情況。

1.2.6 高溫處理對甜菜夜蛾Se301細胞中snRNA表達的影響 鋪1×10個Se301細胞于直徑35 mm的細胞培養皿中，貼壁過夜。分別置于 36 ℃ 和27 ℃條件下培養1 h后，收取細胞樣品，提取小RNA，反轉錄為cDNA，熒光定量PCR方法分析snRNA的表達情況。

1.2.7 SeMNPV感染對甜菜夜蛾snRNA表達的影響 選取發育狀態良好的4齡甜菜夜蛾幼蟲20頭，用帶有SeMNPV多角體(2×10個/幼蟲)的人工飼料喂食，以加無菌水的人工飼料喂食幼蟲為對照。72 h后收取幼蟲血淋巴，提取小RNA，反轉錄為cDNA，熒光定量PCR方法定量分析snRNA的表達情況。

1.2.8 統計與分析 使用SPSS 21.0軟件對試驗結果進行獨立樣本檢驗分析。數據作圖采用GraphPad Prism 7軟件。

2 結果與分析

2.1 甜菜夜蛾U6 snRNA的克隆

從筆者所在課題組的甜菜夜蛾Se301細胞的基因組測序數據的注釋結果中篩選到了甜菜夜蛾snRNA，其序列為(5′→3′)：G U A C U U G C U U C G G C A G U A C A U A U A C U A A A A U U G G A A C G A U A C A G A G A A G A U U A G C A U G G C C C C U G C G C A A G G A U G A C A C G C A A A A U C G U G A A G C G U U C C A C A U U U U U，共107 nt。提取Se301細胞小RNA，通過RT-PCR擴增甜菜夜蛾snRNA。結果顯示，以Se301細胞cDNA和DNA為模板，PCR均擴增出約107 nt的目的條帶，與預期大小相符(圖1)。

回收目的片段，連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態。使用-F/-R引物進行菌落PCR鑒定，結果見圖2-A。挑取陽性克隆，重組質粒pMD18-T-的測序結果表明克隆的snRNA與Se301細胞基因組測序注釋結果中snRNA的序列一致(圖2-B)。

2.2 甜菜夜蛾U6 snRNA的保守性與系統進化分析

通過MEGA7軟件對甜菜夜蛾的snRNA進行系統進化分析。將克隆分析得到的甜菜夜蛾snRNA與從GenBank中搜索獲得的人(NR_004394.1)、黑腹果蠅(，X06669.1)、家蠶(，AY649381.1)、小菜蛾(，KF307745.1)、褐色桔蚜(，KX638479.1)、擬南芥(，NR_141593.1)、慶網蛺蝶(，JX878560.1)、小鼠(，X06980.1)、四膜蟲(，X53790.1)和非洲爪蟾(，NR_033272.1)的snRNA序列進行多序列比對，結果見圖3。多序列比對結果表明snRNA在不同物種中是高度保守的。

對不同物種snRNA的系統進化分析表明，甜菜夜蛾的snRNA與家蠶、小菜蛾和慶網蛺蝶這3個鱗翅目昆蟲的snRNA進化關系最近，說明甜菜夜蛾snRNA與其他鱗翅目昆蟲snRNA同源性最高。此外，鱗翅目昆蟲的snRNA的同源性與同為昆蟲綱物種的褐色橘蚜和黑腹果蠅也比較高。在系統進化分析中可以看出由于甜菜夜蛾snRNA與四膜蟲snRNA的系統進化關系最遠，其snRNA同源性最低，結果見圖4。該結果反映了甜菜夜蛾snRNA的系統進化情況，進一步證實甜菜夜蛾snRNA序列的正確性。

2.3 除蟲菊提取物處理對甜菜夜蛾Se301細胞中U6 snRNA表達的影響

分析除蟲菊提取物農藥脅迫下，Se301細胞中snRNA的表達穩定性。前期分析測定表明，除蟲菊提取物處理Se301的LC為0.29%(體積分數)。使用含0.29%(體積分數)除蟲菊提取物培養基處理Se301細胞后24 h，提取細胞小RNA，RT-qPCR檢測snRNA表達結果顯示(圖5)，除蟲菊提取物處理細胞(值為26.00)與無藥物處理的Se301細胞對照(值為24.67)中snRNA表達量相當。表明除蟲菊提取物LC濃度處理對Se301細胞中snRNA的表達無顯著影響(=0.057>0.05)。

2.4 高溫處理對甜菜夜蛾Se301細胞中U6 snRNA表達的影響

檢測高溫培養(36 ℃)對Se301細胞中snRNA表達的影響。結果表明，Se301細胞在36 ℃和27 ℃培養1 h后，細胞snRNA的表達量相當，值分別為25.04和25.06(圖6)。表明36 ℃高溫處理1 h對Se301細胞中snRNA表達無顯著影響(=0.935>0.05)。

2.5 SeMNPV感染對甜菜夜蛾U6 snRNA表達的影響

進一步探究生物脅迫SeMNPV病毒感染對甜菜夜蛾snRNA表達的影響。收集SeMNPV病毒感染4齡甜菜夜蛾幼蟲72 h后的血淋巴，提取小RNA，RT-qPCR檢測snRNA的表達。結果表明，SeMNPV病毒感染對甜菜夜蛾血淋巴中snRNA的表達無顯著影響(=0.345>0.05)，其中，SeMNPV感染甜菜夜蛾試驗組的值為24.03，未感染的甜菜夜蛾對照組值為23.70，結果見圖7。

3 討論與結論

snRNA作為主要剪接體的重要組分，在各種真核生物細胞中的表達較為穩定，常被用作昆蟲等物種miRNA表達檢測的內參基因。本研究克隆甜菜夜蛾的snRNA序列，分析其系統進化關系以及在不同脅迫條件下的表達穩定性，為其作為內參基因的使用提供依據。

本研究克隆獲得全長為107 nt的甜菜夜蛾snRNA序列。與已報道的果蠅等其他物種序列相同，甜菜夜蛾snRNA 3′末端為5個U的特殊終止序列，符合RNA聚合酶Ⅲ的轉錄產物特征。由于基因轉錄后加工的可變剪接在真核生物中是普遍存在的，snRNA作為主要剪接體的重要組分，在不同真核生物中的進化保守性高。進化分析表明甜菜夜蛾snRNA與家蠶、小菜蛾和慶網蛺蝶這3個鱗翅目昆蟲及同翅目昆蟲褐色橘蚜的snRNA親緣關系最近。目前昆蟲snRNA序列克隆報道尚不多，snRNA在夜蛾科及昆蟲綱中的保守性和進化關系有待更多物種的snRNA序列分析研究。

選擇在不同生理和環境條件下都能穩定表達的內參基因對定量分析結果的準確性十分重要。封冰等研究發現小菜蛾snRNA在幼蟲各發育階段和馬拉硫磷等9種農藥的脅迫下能穩定表達。已報道snRNA作為內參基因用于果蠅、家蠶、草地貪夜蛾和褐飛虱等昆蟲miRNA表達檢測。本研究利用除蟲菊提取物處理、36 ℃高溫培養和SeMNPV感染處理，細胞或幼蟲受脅迫條件下，甜菜夜蛾snRNA表達均未受到顯著影響，能穩定表達。結果表明甜菜夜蛾snRNA適合作為內參基因用于甜菜夜蛾細胞和昆蟲miRNA表達定量檢測的內參基因，以校正因樣品處理和試驗操作等原因造成的試驗誤差。進一步可分析snRNA在甜菜夜蛾不同發育時期、不同組織細胞、不同病原菌侵染和不同時相等條件下的表達穩定性。