貴州草海鯽魚HIF-1α和HIF-2α基因克隆與表達分析

李 青， 葛傳龍， 歐陽力劍， 金志梅， 楊 欽

(1.貴州省典型高原濕地生態保護與修復重點實驗室，貴州畢節 551700； 2.貴州工程應用技術學院生態工程學院，貴州畢節 551700)

云貴高原位于我國西南部，是我國四大高原之一，海拔在400～3 500 m間。貴州草海國家級自然保護區位于云貴高原中部頂端，是一個典型的高原濕地生態系統。鯽魚不僅是我國重要的淡水養殖經濟魚類，而且由于其多生活于水域的中下層，具有極強的低氧耐受性，是公認的低氧耐受力極強的魚類之一。作為草海的優勢魚種，鯽魚在長期高原低氧環境中，進化出特有的身體機能以維持機體O平衡，彌補機體的缺氧反應。

低氧誘導因子HIF是由和亞基組成的一種異質二聚體的轉錄因子，參與了動物缺氧應激的適應和生存過程，在維持機體氧穩態中發揮至關重要的作用。和亞基均包含基本的螺旋-環-螺旋結構基序和PAS結構域。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶PHD通過氧依賴性降解結構域ODD中2個保守的脯氨酸殘基的羥基化作用，使靶蛋白HIF亞基羥基化，隨之羥基化的HIF亞基被VHL蛋白識別并泛素化，介導蛋白降解。HIF激活細胞中一系列缺氧誘導基因的轉錄，以應對缺氧環境。在脊椎動物中HIF至少有3個亞型，分別為HIF1、HIF2和HIF3。魚類中的研究已經證明，HIF1主要在無氧呼吸中間體的氧氣攝取和運輸中起關鍵作用，而HIF2在血管和紅細胞的生成發揮重要作用。目前，關于HIF亞型的研究已在多種魚類中開展，而在耐低氧的鯽魚中的研究還鮮見報道?；诖耍狙芯炕谇捌趯Σ莺ｖa魚轉錄組數據分析，利用生物信息學技術和PCR，克隆獲得了鯽魚中HIF 2個亞型和的全長 cDNA序列，并進行了結構和功能分析。此外，利用實時熒光定量PCR分析了鯽魚中和mRNA在不同組織中的表達情況，以期為進一步深入探究鯽魚耐低氧分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2018年在貴州威寧縣草海采集鯽魚[體長(14.98±4.25) cm；體質量(68.71±5.25) g]，取其腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血組織樣品，放入RNA Later(Tiangen)中，采樣點：26°51′24.15″N，104°12′31.57″E，海拔：2 168.09 m。另采集3尾鯽魚帶回實驗室，取其肝臟組織，液氮冷凍后置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于后續RNA提取。

1.2 鯽魚Ca-HIF1α和Ca-HIF2α全長的克隆與生物信息學分析

提取鯽魚肝臟組織總RNA，將RNA反轉錄為cDNA(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Stramd cDMA Synthesis Kit)。從鯽魚轉錄組數據庫篩選和基因片段，使用DNAstar SeqMan軟件對篩選的目的片段進行拼接。根據拼接獲得的和基因序列設計特異性引物，由表1可知，對拼接獲得序列的正確性進行驗證，克隆獲得和基因的全長cDNA序列。利用DNAMAN軟件分析和基因全長cDNA序列中開放閱讀框及其編碼的氨基酸序列，SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)分析和基因編碼氨基酸序列的功能域，ExPASy(http：//web.expasy.org/protparam)分析和基因編碼蛋白質的分子質量和等電點(pI)。

表1 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列擴增和qRT-PCR引物序列

1.3 HIF1α和HIF2α序列比對和系統進化樹的構建

利用Clustal X軟件比對鯽魚與其他物種的和基因亞型翻譯的氨基酸序列的同源性，并用MEGA 4.0軟件進行同源與聚類分析，采用鄰接法NJ構建系統進化樹，500次自舉(Bootstrap)重復檢驗進化樹的置信度。表2為各物種序列登錄號，來自GenBank。

表2 序列比對和構建進化樹物種信息

1.4 鯽魚Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA表達模式分析

分別提取腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血組織的RNA，將RNA反轉錄為cDNA(TaKaRa SYBR Premix Ex)，根據和基因全長cDNA序列設計特異性引物，鯽魚-基因作為內參，由表1可知引物序列，每個樣本設計3個平行重復，使用BioRad CFX96TM Real-Time PCR檢測系統對和mRNA在不同組織中的表達模式進行分析。

1.5 數據分析

使用Bio-Rad CFX Manager軟件分析熔解曲線，通過2-ΔΔ分析和mRNA的相對表達水平。采用GraphPad Prism 5.0統計軟件中的One-way ANOVA對和mRNA在鯽魚不同組織相對表達量進行分析，<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鯽魚HIF-1α和HIF-2α cDNA序列分析

克隆獲得鯽魚中和cDNA全長序列(GenBank NO.：MW916102，MW916103)，將其分別命名為和。由圖1可知，全長共有3 867 bp，其中，5′UTR為295 bp，3′UTR為1 247 bp，開放閱讀框2 322 bp，編碼774個氨基酸。由圖2可知，cDNA全長共4 647 bp，其中5′UTR為175 bp，3′UTR為 2 023 bp，開放閱讀框2 460 bp，編碼820個氨基酸。生物信息學分析預測和基因編碼蛋白質的分子質量分別為85.844、91.228 ku，等電點為5.12和6.20。SMART在線分析見圖3。由圖3可知，二者具有HLH、PAS和PAC結構域，此外，多序列比對結果顯示二者還具有ODD、N-TAD 和C-TAD功能域。

2.2 HIF1α和HIF2α亞型的同源性分析以及系統進化樹的構建

多序列比對結果見圖4。由圖4可知，鯽魚 Ca-HIF1α 第27個氨基酸是絲氨酸(S)，而Ca-HIF2α相對應的第25個氨基酸是半胱氨酸(C)。Ca-HIF1α和Ca-HIF2α氨基酸序列不僅具有ODD、N-TAD和C-TAD 3個結構域，且ODD結構域具有2個保守的脯氨酸(P)位點，其中，1個是LxxLAP位點，該位點的序列并沒有發生突變。此外，C-TAD結構域均具有保守的天冬酰胺(N)位點，表明Ca-HIF1α 和Ca-HIF2α結構域的保守性。進化樹顯示，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α分別與其他物種中相應的亞型聚為一支。但Ca-HIF1α是先與花斑裸鯉、納木錯裸鯉、扁咽齒魚、黃河裸裂尻魚、齊口裂腹魚、鯉魚的HIF1α聚為一支后，再與南亞野鯪的HIF1α聚為一支，最后與白鰱、草鯉魚和團頭魴的HIF1α聚在一起。與之不同，白鰱、草鯉魚和團頭魴HIF2α先聚為一支，南亞野鯪、齊口裂腹魚、花斑裸鯉、納木錯裸鯉、黃河裸裂尻魚和扁咽齒魚聚為一支，然后2支匯聚，最后再與Ca-HIF2α聚在一起，提示Ca-HIF2α比Ca-HIF1α進化得要快。

2.3 Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA在鯽魚不同組織中的表達

由圖5可知，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)結果顯示，和mRNA在所有被檢測的組織中均有表達，其中，mRNA在所有組織中的相對表達量均高于mRNA的表達量。此外，mRNA在肝臟、鰓和精巢組織中的相對表達量最高，全血、心臟、腎臟、肌肉、脾臟和卵巢組織中的相對表達量次之，在腸組織中的相對表達量最低。與之相似，mRNA在肝臟、鰓和全血組織中的相對表達量最高，卵巢、精巢、脾臟、心臟、腎臟和肌肉組織中的相對表達量次之，在腸組織中的相對表達量最低。

3 討論

3.1 鯽魚中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α基因序列與系統進化分析

本研究克隆獲得鯽魚中基因2個亞型的全長cDNA序列，對序列比對構建進化樹顯示二者分別與其他物種中的HIF1α和HIF2α聚為一支。因此，將其分別命名為和。與其他物種中的同源蛋白一樣，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α均具有HLH、PAS-A、PAS-B、PAC、N-TAD和C-TAD 6個結構功能域，表明組成HIF1α和HIF2α的主要結構域是高度保守的。與巨鯛()和HIF1α相關研究結果一致，Ca-HIF1α第27個氨基酸是絲氨酸(S)，Ca-HIF2α對應位點的第25個氨基酸是半胱氨酸(C)，HIFα中HLH結構域中還原性半胱氨酸的存在主要與介導動物的氧敏感性有關，此不同之處導致Ca-HIF2α在DNA結合過程中可能比Ca-HIF1α對氧化還原更敏感。Ca-HIF1α與Ca-HIF2α結構上的這些區別可能導致二者具有各自獨特的功能，且Ca-HIF2α在系統進化中比Ca-HIF1α要快。然而，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在ODD結構域均具有2個保守的脯氨酸(P)，且與人類中的HIFα同源蛋白相似，保有了LxxLAP位點，LxxLAP位點的突變是動物適應高原低氧環境的重要標志，這可能與鯽魚是耐低氧動物有關。此外，Ca-HIF1α和Ca-HIF2α在C-TAD結構域均具有天冬酰胺，2個保守的脯氨酸主要參與了蛋白質周轉，天冬酰胺主要參與誘導靶基因的轉錄，這些殘基的保守性，表明其在促進魚類和哺乳動物的轉錄活性方面具有功能保守性。

3.2 鯽魚不同組織中Ca-HIF1α和Ca-HIF2α mRNA水平表達差異分析

實時熒光定量PCR結果顯示，在常氧條件下，和mRNA在所檢測組織(腸、肝臟、鰓、心臟、腎臟、肌肉、脾臟、精巢、卵巢和全血)中均有表達，與巨鯛()、斑馬魚、齊口裂腹魚()和軟刺裸鯉()中研究結果相一致，和mRNA在鰓組織中的表達量均最高。此外，與巨鯛()相似，mRNA在鯽魚肝臟和精巢組織中的表達量均很高。而mRNA在卵巢組織中表達量較高，mRNA在卵巢組織中的表達量較低。與同時耐低氧的草魚中結果不同，和mRNA在鯽魚的腎臟組織中表達量均不高。和mRNA在鯽魚腸組織中的低表達，可能是由于腸道組織水平的日常變化，二者參與了腸道穩態的維持。以上結果說明-在維持機體氧穩態方面發揮至關重要作用，但和這2個亞型mRNA水平的表達差異性表明二者在調控氧穩態方面具有分工。此外，二者在精巢、卵巢和全血組織中的表達，推測其可能參與介導了血細胞和生殖細胞的發育。