同步輻射X射線成像：繪制“大腦地圖”的利器

湯喬偉 胡鈞 樊春海 諸穎

“光”是生活中不可或缺的資源，人類的發(fā)展歷程離不開光的使用。早在2 400年前的古希臘，亞里士多德就對(duì)光產(chǎn)生了思考，雖然其理論后續(xù)被證實(shí)是錯(cuò)誤的，但還是對(duì)光的研究產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。生活中肉眼可見的光是“可見光”，根據(jù)波長(zhǎng)的不同，光還可以分為無(wú)線電波、紅外、紫外、X射線和Y射線等。

當(dāng)可見光照射人體時(shí)，會(huì)有一部分光反射到我們的眼睛中，所以我們“看到”了他人。但是當(dāng)X射線照射到人體時(shí)，則會(huì)穿透人體，通過(guò)X光底片記錄不同角度穿透人體的程度，就可以復(fù)原人體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。這也是臨床中X光電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）的原理。

如何利用“光”幫助研究大腦呢？臨床中醫(yī)生通過(guò)X光CT對(duì)頭部進(jìn)行掃描研究腦的結(jié)構(gòu)與形態(tài)，觀察其病變情況；光遺傳學(xué)中，研究光調(diào)控神經(jīng)元的活動(dòng)；鈣成像中，研究者通過(guò)觀察“閃爍”的神經(jīng)元記錄其活動(dòng)；熒光成像中，研究者通過(guò)向動(dòng)物大腦注射病毒使神經(jīng)元發(fā)出“熒光”從而觀察神經(jīng)元的形態(tài)。諸如此類的方法還有很多， “光”伴隨著大腦的研究。我們?cè)谶@里重點(diǎn)介紹利用基于同步輻射光源的X射線成像對(duì)大腦，尤其是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行的研究。

從二維到三維神經(jīng)元成像

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，對(duì)大腦的研究離不開對(duì)神經(jīng)元的研究。1873年卡米洛·高爾基（Camillo Golgi）發(fā)明了高爾基染色法，染色后神經(jīng)元呈現(xiàn)黑色，首次展現(xiàn)了神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)。接著，卡哈爾（Cajal）對(duì)高爾基染色法進(jìn)行了完善，使其更好地應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究。1906年，高爾基和卡哈爾被共同授予諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

人類大腦中約有上千億個(gè)神經(jīng)元，每個(gè)神經(jīng)元又會(huì)和成百上千個(gè)神經(jīng)元通過(guò)突觸連接。想要分析這些神經(jīng)元如何整合成一個(gè)系統(tǒng)并發(fā)揮作用，繪制“大腦地圖”是重要的突破點(diǎn)。我們知道，繪制道路地圖需要標(biāo)明地點(diǎn)和道路，繪制“大腦地圖”也一樣。神經(jīng)元的胞體像是地點(diǎn)，神經(jīng)元之間的連接像是道路。而繪制地圖則離不開對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的成像。

受限于技術(shù)，研究者在早期對(duì)神經(jīng)元的成像更多停留在二維的組織切片中。對(duì)神經(jīng)元的二維成像取得了出色的成果，如1954年利用電子顯微鏡第一次觀察到突觸間隙，從而證明卡哈爾的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模式理論的正確性。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，研究者更希望在三維層面上觀察神經(jīng)元，于是三維成像技術(shù)開始應(yīng)用于神經(jīng)元成像中。從早期的核磁共振成像、CT成像等技術(shù)，到近些年來(lái)發(fā)展的連續(xù)切片電子顯微鏡（SSEM）、顯微光學(xué)斷層掃描系統(tǒng)（MOST）等，在不同尺度上為人們揭開了神經(jīng)元的神秘面紗。正因?yàn)橛辛诉@些技術(shù)，繪制“大腦地圖”成為可能。

繪制人類“大腦地圖”的挑戰(zhàn)

繪制“大腦地圖”容易嗎？1986年，研究者通過(guò)電子顯微鏡成像繪制出了線蟲的第一張大腦全連線圖，線蟲擁有302個(gè)神經(jīng)元，這項(xiàng)工作耗費(fèi)了整整15年的時(shí)間。近年來(lái)，計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和成像設(shè)備的更新?lián)Q代使得獲得圖像的速度大幅度提升，但對(duì)于繪制人類“大腦地圖”還需要進(jìn)一步提升成像速度。

2021年，哈佛和谷歌的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)電子顯微鏡以4 nm的分辨率對(duì)人類大腦皮層進(jìn)行了約5 000片30 nm厚的連續(xù)掃描，完成了“百萬(wàn)分之一”人腦神經(jīng)三維連接圖譜。盡管樣品僅有針頭大小，但其中耗費(fèi)的時(shí)間和精力是難以想象的。該圖譜的數(shù)據(jù)量也達(dá)到了驚人的1.4 PB，如果用市面上常見的512 GB儲(chǔ)存空間的筆記本電腦來(lái)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)，要使用近3 000臺(tái)電腦。所以，按照當(dāng)前的技術(shù)水平，利用電子顯微鏡來(lái)獲取完整的人腦神經(jīng)三維連接圖譜是不可能的。

2010年，MOST的問(wèn)世給研究大腦三維結(jié)構(gòu)帶來(lái)了巨大的便利，MOST可在數(shù)天內(nèi)完成介觀尺度下小鼠大腦的三維成像。2022年，中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心和華中科技大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)合作，對(duì)小鼠前額葉皮層的6 357個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像，構(gòu)建了最大的小鼠前額葉單神經(jīng)元投射圖譜。MOST的成像速度和高分辨能力使其廣泛地應(yīng)用于小鼠等模式動(dòng)物的全腦成像及圖譜構(gòu)建。但是，面對(duì)人腦如此大的體量，使用MOST獲取數(shù)據(jù)也需要耗費(fèi)大量時(shí)間。

近些年來(lái)從事腦科學(xué)的研究者關(guān)注到了基于同步輻射光源的X射線成像技術(shù)，并應(yīng)用到神經(jīng)元的成像中，那基于同步輻射光源的X射線成像技術(shù)有何優(yōu)勢(shì)呢？

同步輻射光源的X射線

當(dāng)帶電粒子在電磁場(chǎng)中以接近光速的速度沿曲線軌道運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)在其運(yùn)動(dòng)的切線方向發(fā)出電磁輻射。由于它最初在同步加速器上被發(fā)現(xiàn)，故被稱為“同步輻射”。從同步輻射裝置問(wèn)世至今已出現(xiàn)了四代裝置。第一代是依托于高能物理研究的加速器；第二代專門為同步輻射應(yīng)用設(shè)計(jì)；第三代擁有更高的亮度，更好的時(shí)間分辨率和空間分辨率；第四代是自由電子激光器。相比較于傳統(tǒng)光源，同步輻射光源擁有高亮度、高準(zhǔn)直性和高偏振等優(yōu)勢(shì)，并且覆蓋了從遠(yuǎn)紅外到X射線波段的連續(xù)光譜。

第二、三、四代同步輻射光源原理圖

X射線由德國(guó)科學(xué)家倫琴在19世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)，其擁有豐富的輻射-物質(zhì)相互作用，包括吸收、衍射、散射和熒光等相互作用。基于此開發(fā)了一系列的實(shí)驗(yàn)方法：X射線吸收成像、X射線衍射、小角X射線散射和X射線熒光等。想要“看清”神經(jīng)元、蛋白質(zhì)和病毒等微小結(jié)構(gòu)就需要選擇波長(zhǎng)較短的光。X射線波長(zhǎng)短，是探索微觀世界的重要工具。

通過(guò)X-PCI成像后三維可視化的浦肯野細(xì)胞及分子層和顆粒層細(xì)胞

基于同步輻射光源的X射線具有高準(zhǔn)直性，可近似平行光入射，并且具有高純凈性，無(wú)雜質(zhì)污染。同步輻射X光應(yīng)用于神經(jīng)元成像最大的優(yōu)勢(shì)在于其高亮度，第三代同步輻射光源的X射線亮度是X光機(jī)的上億倍。這不僅提升了X射線的穿透深度，同時(shí)也減少了曝光時(shí)間，大幅度提升了獲取成像數(shù)據(jù)的速度。

基于同步輻射光源的X射線成像

目前已有一系列基于同步輻射光源的X射線成像技術(shù)應(yīng)用到神經(jīng)元成像的相關(guān)研究中，其中應(yīng)用最廣泛的是硬X射線的相關(guān)技術(shù)。硬X射線的波長(zhǎng)在0.01 nm到0.1 nm，相較于波長(zhǎng)較長(zhǎng)的軟X射線，其具有更高的穿透能力。基于同步輻射光源的X射線相襯成像（X-PCI）、微米X射線斷層掃描（Micro-CT）和X射線納米全息層析成像（XNH）等相關(guān)技術(shù)在神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的成像中發(fā)揮了重要的作用。

X-PCI技術(shù)利用軟組織樣品對(duì)X射線相位信息的響應(yīng)，獲得X射線對(duì)比度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的無(wú)標(biāo)記成像。該技術(shù)對(duì)神經(jīng)元的胞體以及浦肯野細(xì)胞等具有較好的成像效果，并可同時(shí)成像神經(jīng)元和血管。近年來(lái)，有研究者利用X-PCI對(duì)無(wú)標(biāo)記的人類小腦進(jìn)行研究，對(duì)位于不同腦區(qū)的神經(jīng)元胞體進(jìn)行分布研究，并且從數(shù)據(jù)集中分割出浦肯野細(xì)胞。

XNH技術(shù)根據(jù)樣品引起光束細(xì)微相移的變化來(lái)獲取圖像，并結(jié)合全息和層析重建來(lái)獲取圖像。該技術(shù)分辨率高，各向同性體素分辨率可以達(dá)到25 nm，且成像速度快，通過(guò)XNH技術(shù)可在12小時(shí)內(nèi)完成各向同性分辨率50 nm的果蠅全腦成像。2020年，哈佛的研究者通過(guò)XNH掃描追蹤了果蠅肌肉到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單根運(yùn)動(dòng)軸突，證明了XNH的快速成像和追蹤能力。

Micro-CT基于硬X射線吸收成像。由于硬X射線對(duì)高原子序數(shù)的元素有強(qiáng)吸收，而對(duì)碳、氫、氧等低原子序數(shù)的元素吸收很弱，所以利用Micro-CT對(duì)神經(jīng)元成像需要對(duì)神經(jīng)元染色。高爾基染色法的染液中含有汞、鉻等高原子序數(shù)元素，對(duì)硬X射線有強(qiáng)吸收，從而擁有出色的X射線對(duì)比度。研究者通過(guò)Micro-CT在幾分鐘內(nèi)完成了對(duì)果蠅大腦各向同性分辨率300 nm的數(shù)據(jù)采集，并在數(shù)天內(nèi)完成了小鼠大腦的數(shù)據(jù)集采集。

通過(guò)Micro-CT成像后三維可視化的果蠅頭部

除了上述技術(shù)之外，基于同步輻射的透射X射線顯微（TXM）技術(shù)也可用于神經(jīng)元成像。該技術(shù)采用空心環(huán)形光照明，空間分辨率和成像視場(chǎng)僅受菲涅爾波帶片的限制。TXM的分辨率高且成像速度快，已有研究者實(shí)現(xiàn)了1分鐘50 nm空間分辨率的納米層析成像，并有分辨率小于10 nm的快速3D層析成像（85 分鐘），這一分辨率已經(jīng)逼近了電子顯微鏡常用的4 nm分辨率。目前，已有通過(guò)TXM觀測(cè)神經(jīng)元軸突和樹突棘的報(bào)道，相信不久的未來(lái)，TXM技術(shù)將廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元成像。

同步輻射X射線成像是繪制“大腦地圖”的利器

基于同步輻射光源的X射線成像相比較于其他三維成像技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：

（1）同步輻射光源的X射線具有高亮度，這保證了其穿透深度，在此前的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)其可以穿透數(shù)毫米的未透明化的腦組織塊，降低了多組數(shù)據(jù)配準(zhǔn)的工作量和難度。

（2）該方法具有各向同性分辨率，尤其是Z軸上具有高分辨率。光學(xué)成像方法中提高Z軸分辨通常需要減少切片和光學(xué)切片的厚度，使得采樣的時(shí)間大幅度增加。

（3）該方法樣品制備簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)樣品透明化處理和薄切片，通過(guò)XNH和X-PCI技術(shù)，還可以實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記的神經(jīng)元成像，最大程度保證了樣品的完整性并可用于后續(xù)的其他研究。

（4）向腦區(qū)注射病毒是熒光成像中常用的手段，但這不能應(yīng)用于人腦中。基于同步輻射光源的X射線成像可以使用高爾基染色或鋨酸染色，而此類染色方法可對(duì)死亡后的人腦組織進(jìn)行固定和染色。不同于熒光成像，基于同步輻射光源的X射線成像無(wú)光漂白現(xiàn)象，并且可以長(zhǎng)時(shí)間成像和反復(fù)成像。

（5）基于同步輻射光源的X射線成像獲取數(shù)據(jù)速度快，就Micro-CT而言，成像速度目前最快可以達(dá)到1mm3/min組織，是目前成像速度最快的三維成像手段。

繪制人類“大腦地圖”的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

繪制“人腦地圖”是一個(gè)巨大的工程，現(xiàn)階段無(wú)法通過(guò)單課題組完成。由中國(guó)上海光源（SSRF）、中國(guó)臺(tái)灣同步輻射研究中心（NSRRC）、韓國(guó)浦項(xiàng)光源（Pohang Light Source）、新加坡光源中心（SSLS）、日本Spring-8光源、澳大利亞以及泰國(guó)光源等共同成立的大科學(xué)裝置群的同步輻射神經(jīng)科學(xué)亞太聯(lián)盟（SYNAPSE），旨在繪制全世界首幅人全腦介觀X射線連接圖譜成像。以目前1 mm3/min的成像速度，十條相關(guān)同步輻射X射線成像線站協(xié)作，完成人全腦介觀尺度X射線成像所用時(shí)間不到90天。

現(xiàn)階段仍有一系列問(wèn)題需要攻克，例如大數(shù)據(jù)的處理和配準(zhǔn)、高爾基染色方法的改良等。先進(jìn)的同步輻射大科學(xué)裝置群的協(xié)作加上一系列染色、數(shù)據(jù)處理技術(shù)的支持和突破，繪制人類“大腦地圖”將只是時(shí)間問(wèn)題，基于同步輻射光源的X射線成像技術(shù)將是完成這一偉大工程的利器。