Nrf2調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能轉(zhuǎn)化在腦出血后血腫清除中的作用機(jī)制*

包霜謹(jǐn)，劉麗榮，要振佳，柏琴琴，梁春甜，符鵬程，劉祥玉，王改青

[1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西太原 030001；3.深圳龍華區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東深圳 518110；4.海南醫(yī)學(xué)院附屬三亞中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南三亞572000]

腦出血的發(fā)病率和病死率高，血腫及其降解產(chǎn)物是導(dǎo)致腦出血預(yù)后不良的主要原因[1]。研究[2]表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與腦出血后的血腫清除。腦出血后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分為促炎和抗炎兩種狀態(tài)[3]。促炎表型以產(chǎn)生腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、CD80、CD86 等為特征，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，促進(jìn)神經(jīng)炎癥。而白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和CD206 等抗炎分子的分泌代表小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，可減輕炎癥，促進(jìn)神經(jīng)功能的修復(fù)[4]。除此之外，髓樣細(xì)胞上表達(dá)的I型受體（recombinant human triggering receptor expressed on myeloid cells 1, Trem1）是小膠質(zhì)細(xì)胞重要的炎癥放大因子[5-6]，而髓樣細(xì)胞上表達(dá)的Ⅱ型受體（recombinant human triggering receptor expressed on myeloid cells 2, Trem2）具有吞噬、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[7-8]。 核因子紅系相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2）和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）作為調(diào)節(jié)因子在清除內(nèi)源性血腫中的作用引起了廣泛的關(guān)注[1]。本團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)了Nrf2 激動(dòng)劑紅曲素能促進(jìn)腦出血后血腫的清除并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9-10]，并且發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制Trem1可改善蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的神經(jīng)功能缺損和腦水腫[11]。Nrf2 是否通過(guò)影響小膠質(zhì)細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)化發(fā)揮血腫清除的作用目前尚不明確。本研究通過(guò)探討Nrf2 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步從細(xì)胞水平探究腦出血后Nrf2 在血腫清除中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的各項(xiàng)規(guī)定。雄性C57BL/6 小鼠34 只，4～5 周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（晉）2019-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（晉）2019-007]。雄性Nrf2 基因敲除小鼠（Nrf2 knockout mice, Nrf2-/-）C57BL/6 小鼠8 只，4～5 周齡，體重（20±1）g，購(gòu)自Cyagen模型生物學(xué)研究中心（太倉(cāng)）有限公司（中國(guó)蘇州）[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-005]。均在適宜的濕度及溫度條件下飼養(yǎng)，保證自由飲水及攝食。

1.2 藥物、試劑及儀器

賽拉嗪（上海麥克林生化科技有限公司，規(guī)格：1 g），氯胺酮（福建古田藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 g），Ⅳ型膠原酶（上海索萊寶生物科技有限公司），紅曲素（上海子起生物科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：55WXQ-XC60，規(guī)格：1 g），血脂康（北大維信公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z10950029，規(guī)格：1 g）。生理鹽水（江西科達(dá)衛(wèi)生用品有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）、RIPA 緩沖液、牛血清白蛋白、BCA 試劑盒、SDS 聚丙烯酰胺凝膠（武漢博士德生物工程有限公司），文齊式液（上海信帆生物科技有限公司），4%多聚甲醛（上海源葉生物有限公司），蔗糖緩沖液（PBS配置，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），倉(cāng)鼠抗CD80、兔抗CD206、山羊抗小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白（ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba1）、兔抗Nrf2、大鼠抗Trem2、兔抗Trem1、兔抗TNF-α、兔抗BDNF、β-actin（美國(guó)Abcam 公司），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）標(biāo)記兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G, IgG）、CY3-兔抗大鼠IgG（H+L）（武漢博士德生物工程有限公司），山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 647）、山羊抗倉(cāng)鼠IgG H&L（FITC）（美國(guó)Abcam 公司），含4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenyl indole, DAPI）的防淬滅封片劑、ECL 發(fā)光液（上海索萊寶生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（美國(guó)Millipore 公司）。立體定位儀、顱骨鉆（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司），微量注射器（上海高鴿工貿(mào)有限公司），骨蠟（上海強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司），分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），冷凍切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），烘箱（上海合恒儀器設(shè)備有限公司），TS2R 熒光顯微鏡（日本尼康公司），搖床（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 模型復(fù)制

腹腔注射賽拉嗪10 mg/kg 和氯胺酮100 mg/kg麻醉小鼠，以俯臥位固定于立體定位儀，對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域的皮膚進(jìn)行消毒、備皮后，沿頭皮正中做一縱行切口，剔除骨膜，暴露前囟，通過(guò)坐標(biāo)（前囟后0.9 mm，中線外側(cè)1.5 mm，深度3.5 mm）定位小鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)，用顱骨鉆做一孔徑約1 mm 的小孔，采用微量注射器抽取0.3 u Ⅳ型膠原酶注射至小鼠的右側(cè)基底節(jié)區(qū)，然后固定于立體定位儀上，調(diào)節(jié)定位儀使其針頭經(jīng)小孔進(jìn)針3.5 mm，針頭在此位置保持15 min 不動(dòng)，然后退針，用骨蠟封閉小孔，最后縫皮。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)估

待模型小鼠清醒后，采用改良Garcia 評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能[12-13]。修改后的量表包含6 項(xiàng)獨(dú)立測(cè)試，分別是自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱(chēng)性、前肢伸展運(yùn)動(dòng)、抓持和攀爬鐵籠的能力、兩側(cè)身體觸覺(jué)反射及兩側(cè)胡須碰觸反應(yīng)。每項(xiàng)測(cè)試0～3 分，總分18 分，分?jǐn)?shù)越高，神經(jīng)功能缺損的程度越重。

1.5 分組

隨機(jī)將C57BL/6 小鼠分為對(duì)照組（n=8）、腦出血組（n=9）、腦出血+紅曲素組（n=8）、腦出血+血脂康組（n=9）；Nrf2-/-C57BL/6 小鼠為腦出血+Nrf2-/-組（n=8）。對(duì)照組以生理鹽水代替Ⅳ型膠原酶完成手術(shù)，術(shù)后給予生理鹽水灌胃，1 次/d；腦出血組術(shù)后給予生理鹽水灌胃1 次/d；腦出血+紅曲素組術(shù)后給予紅曲素10 mg/（kg·d），2 次/d；腦出血+血脂康組術(shù)后給予血脂康0.2 g/（kg·d），2 次/d；腦出血+Nrf2-/-組術(shù)后給予生理鹽水灌胃，1 次/d。腦出血+血脂康組和腦出血+紅曲素組小鼠在術(shù)后6 h 灌胃給藥，直至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中采用的給藥途徑、方法及取腦的時(shí)間點(diǎn)選擇均基于本課題組的前期研究；前期本課題組觀察Nrf2 的時(shí)間點(diǎn)，已表明在腦出血后的72 h，血腫周?chē)难t蛋白含量、腦水含量及水腫體積均達(dá)到峰值，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，10 mg/（kg·d）紅曲素組的Nrf2 陽(yáng)性細(xì)胞最多[10，12-13]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，選擇腦出血后的72 h 作為時(shí)間點(diǎn)，探究Nrf2 在腦出血后血腫清除中的作用機(jī)制。

1.6 血紅蛋白水平測(cè)定

腹腔麻醉后打開(kāi)小鼠的胸腔，用預(yù)冷的PBS 進(jìn)行心臟灌注，待流出的液體清亮?xí)r停止灌注。斷頭取腦，于-80℃儲(chǔ)存腦組織。取血腫周?chē)哪X組織于1 100 μL PBS 中勻漿，4℃15 000 r/min 離心30 min 并收集上清液。按上清液∶文齊式液為1∶4比例混勻，室溫反應(yīng)5 min 后，在分光光度計(jì)上測(cè)定540 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。根據(jù)吸光度計(jì)算血紅蛋白水平，各組測(cè)定值的均值/手術(shù)對(duì)照組測(cè)定值的均值代表各組的平均血腫量。

1.7 免疫熒光檢測(cè)

小鼠深度麻醉后，經(jīng)心臟灌注PBS 和4%多聚甲醛。斷頭取腦組織，標(biāo)本浸泡在4%多聚甲醛中4℃過(guò)夜，隔日分別用20%、30%的蔗糖緩沖液4°C下脫水，直至組織完全滲透。采用冷凍切片機(jī)冠狀切片標(biāo)本，厚度4 μm。將冷凍切片放至50°C 烘箱1 h 固定后，PBS 漂洗3 次，每次5 min，以1%的牛血清白蛋白封閉。封閉結(jié)束后分別按照以下比例進(jìn)行一抗的過(guò)夜孵育：倉(cāng)鼠抗CD80（1：200）/兔抗CD206（1∶200）、山羊抗Iba1（1∶200）/兔抗Nrf2（1∶100）、大鼠抗Trem2（1∶200）/ 山羊抗Iba1（1∶200）和兔抗Trem1（1∶100）/山羊抗Iba1（Iba1 1∶200），PBS 漂洗后，避光條件下進(jìn)行熒光二抗的孵育：FITC 標(biāo)記兔抗山羊IgG（1∶500），山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 647）（1∶300），山羊抗倉(cāng)鼠IgG H&L（FITC）（1∶600），CY3-兔抗大鼠IgG（H+L）（1∶500）。孵育結(jié)束后，PBS 漂洗，稍晾干后在組織中央滴加含DAPI 的防淬滅封片劑封片，在TS2R 熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

取小鼠腦血腫周?chē)男迈r腦組織，在RIPA緩沖液中勻漿（含蛋白酶抑制劑），4℃下靜置并12 000 r/min 離心10 min，收集上清液后采用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。將等量的待測(cè)蛋白溶液加到SDS 聚丙烯酰胺凝膠上，待電泳后目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入兔抗TNF-α（1∶2 000）、兔抗BDNF（1∶1 000）、兔抗Nrf2（1∶1 000）、倉(cāng)鼠抗CD80（1∶1 000）、兔抗CD206（1∶1 000）、兔抗Trem1（1∶1 000）、大鼠抗Trem2（1∶1 000）4°C 下過(guò)夜孵育，β-actin（1∶1 000）作為參照。第2 天，用PBS 清洗后孵育相應(yīng)的二抗：山羊抗兔IgG 抗體（1∶5 000），山羊抗倉(cāng)鼠IgG 抗體（1∶5 000），兔抗大鼠IgG（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育2 h，采用ECL 發(fā)光液曝光。采用Image J 軟件計(jì)算灰度值，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 7.0 圖形分析軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用Fisher 精確概率法；相關(guān)分析用Pearson 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型復(fù)制結(jié)果

對(duì)照組、腦出血+紅曲素組、腦出血+Nrf2-/-組均存活。腦出血組因蛛網(wǎng)膜下腔出血死亡1 只，腦出血+血脂康組藥物干預(yù)后死亡1 只。小鼠的手術(shù)總死亡率為4.7%（2/42）。

2.2 各組小鼠改良Garcia評(píng)分及血紅蛋白水平比較

5 組小鼠的改良Garcia 評(píng)分和血紅蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，腦出血組改良Garcia 評(píng)分降低（P=0.004），血紅蛋白水平升高（P＜0.05）；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的改良Garcia 評(píng)分升高（P=0.038）、血紅蛋白水平降低（P＜0.05），腦出血+血脂康組的改良Garcia 評(píng)分升高（P=0.021）、血紅蛋白水平降低（P＜0.05），腦出血+Nrf2-/-組的改良Garcia 評(píng)分降低（P＜0.05）、血紅蛋白水平升高（P=0.007）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠改良Garcia評(píng)分及血紅蛋白水平比較（n=8，±s）

表1 各組小鼠改良Garcia評(píng)分及血紅蛋白水平比較（n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值血紅蛋白/g/L 1.015±0.008 2.492±0.058①2.725±0.133①②1.378±0.210①②1.287±0.262①②144.300 0.000改良Garcia評(píng)分17.710±0.756 14.250±1.709①6.375±2.066①②16.780±1.581①②17.000±1.309①②72.360 0.000

2.3 各組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)

5 組小鼠Nrf2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，腦出血組Nrf2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.022）；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組（P= 0.007）和腦出血+血脂康組（P=0.000）的Nrf2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，腦出血+Nrf2-/-組的Nrf2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.000）（見(jiàn)圖1和表2）。免疫熒光檢測(cè)證實(shí)Nrf2表達(dá)的相似模式（見(jiàn)圖2）。

圖2 各組小鼠Nrf2蛋白表達(dá)的免疫熒光圖 （×400）

表2 各組小鼠Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

表2 各組小鼠Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值Nrf2 0.486±0.096 0.841±0.339①0.096±0.026①②1.252±0.245①②1.478±0.169①②44.110 0.000

圖1 各組小鼠Nrf2蛋白的表達(dá)

2.4 各組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Trem1、Trem2蛋白的表達(dá)

5 組小鼠Trem1、Trem2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，腦出血組Trem1（P=0.000）、Trem2（P=0.001）蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的Trem1 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.046）、Trem2 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P=0.002），腦出血+血脂康組的Trem1 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.046）、Trem2 蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P=0.000），腦出血+Nrf2-/-組的Trem1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.025）、Trem2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.000）（見(jiàn)圖3和表3）。免疫熒光檢測(cè)證實(shí)了Trem1、Trem2 表達(dá)的相似模式（見(jiàn)圖4）。

圖3 各組小鼠Trem1、Trem2蛋白的表達(dá)

圖4 各組小鼠Trem1、Trem2蛋白表達(dá)的免疫熒光圖 （×400）

表3 各組小鼠Trem1、Trem2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值Trem2 0.292±0.076 0.518±0.114①0.152±0.067①②0.722±0.092①②0.976±0.079①②86.940 0.000 Trem1 0.253±0.114 0.931±0.203①1.259±0.248①②0.634±0.155①②0.633±0.224①②22.310 0.000

2.5 各組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞CD80、CD206蛋白的表達(dá)

5 組小鼠CD80、CD206 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，腦出血組CD80 和CD206 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加（均P=0.000）；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的CD80 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.000）、CD206 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.026），腦出血+血脂康組的CD80 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.000）、CD206 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.000），腦出血+Nrf2-/-組的CD80 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.029）、CD206 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.020）（見(jiàn)圖5和表4）。免疫熒光檢測(cè)證實(shí)了CD80 和CD206 表達(dá)的相似模式（見(jiàn)圖6）。

圖6 各組小鼠CD80、CD206蛋白表達(dá)的免疫熒光圖 （×400）

表4 各組小鼠CD80、CD206蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s）

表4 各組小鼠CD80、CD206蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值CD206 0.251±0.112 0.618±0.157①0.381±0.085②0.848±0.178①②1.052±0.132①②34.710 0.000 CD80 0.180±0.052 1.001±0.136①1.222±0.094①②0.600±0.218①②0.598±0.093①②56.830 0.000

圖5 各組小鼠CD80、CD206蛋白的表達(dá)

2.6 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

5 組小鼠TNF-α、BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與對(duì)照組比較，腦出血組TNF-α（P=0.000）和BDNF（P=0.024）蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高；與腦出血組比較，腦出血+紅曲素組的TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.009）、BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.021），腦出血+血脂康組的TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.010）、BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.003），腦出血+Nrf2-/-組的TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.014）、BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.000）。見(jiàn)圖7和表5。

表5 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s）

表5 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與腦出血組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組腦出血組腦出血+Nrf2-/-組腦出血+紅曲素組腦出血+血脂康組F 值P 值BDNF 0.345±0.165 0.606±0.169①0.109±0.057①②0.873±0.158①②0.941±0.186①②31.290 0.000 TNF-α 0.280±0.121 0.979±0.151①1.334±0.330①②0.604±0.130①②0.609±0.161①②25.990 0.000

圖7 各組小鼠TNF-α、BDNF蛋白表達(dá)

2.7 Trem1與改良Garcia評(píng)分的相關(guān)性

小鼠腦出血后，小膠質(zhì)細(xì)胞Trem1 蛋白表達(dá)與改良Garcia 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.956，P=0.000），即小膠質(zhì)細(xì)胞Trem1 蛋白表達(dá)越多，神經(jīng)功能恢復(fù)越差。見(jiàn)圖8。

圖8 小膠質(zhì)細(xì)胞Trem1蛋白表達(dá)與改良Garcia評(píng)分的相關(guān)性

2.8 Trem2與改良Garcia評(píng)分、血紅蛋白的相關(guān)性

小鼠腦出血后，小膠質(zhì)細(xì)胞Trem2 蛋白表達(dá)與改良Garcia 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.936，P=0.000），與血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)（r=-0.473，P=0.009）。即小膠質(zhì)細(xì)胞Trem2 蛋白表達(dá)越多，血紅蛋白水平越低，神經(jīng)功能恢復(fù)越好。見(jiàn)圖9、10。

圖9 小膠質(zhì)細(xì)胞Trem2蛋白表達(dá)與改良Garcia評(píng)分的相關(guān)性

圖10 小膠質(zhì)細(xì)胞Trem2蛋白表達(dá)與血紅蛋白的相關(guān)性

3 討論

本研究結(jié)果顯示，腦出血+紅曲素組和腦出血+血脂康組C57BL/6 小鼠的Nrf2 表達(dá)升高，腦出血+Nrf2-/-組Nrf2 的表達(dá)降低，這表明激動(dòng)劑和基因敲除小鼠對(duì)Nrf2 的調(diào)控作用。紅曲素和血脂康作為Nrf2 的激動(dòng)劑，可上調(diào)CD206、Trem2 及BDNF 的表達(dá)，下調(diào)CD80、Trem1 及TNF-α 的表達(dá)，而腦出血+Nrf2-/-組的結(jié)果相反，這表明Nrf2 可能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎及吞噬功能轉(zhuǎn)化。腦出血+紅曲素組和腦出血+血脂康組血紅蛋白水平降低，提示藥物能改善腦出血后小鼠神經(jīng)功能缺損；而腦出血+Nrf2-/-組的結(jié)果相反，提示Nrf2 參與了腦出血后血腫的清除和神經(jīng)功能的改善。Trem1 蛋白表達(dá)與改良Garcia 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，Trem2 蛋白表達(dá)與改良Garcia 評(píng)分呈正相關(guān)，與血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)，提示Trem2 可能促進(jìn)血腫產(chǎn)物的清除及改善神經(jīng)功能，Trem1 加重神經(jīng)功能的缺損。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，被激活后會(huì)發(fā)生形態(tài)和功能上的改變。激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)免疫反應(yīng)，釋放的炎癥介質(zhì)是神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，并且可通過(guò)改變各種表面受體來(lái)發(fā)揮抗炎或者促炎作用[14]；在小膠質(zhì)細(xì)胞激活過(guò)程中存在一個(gè)自反饋級(jí)聯(lián)環(huán)路，這些炎癥信號(hào)被小膠質(zhì)細(xì)胞激活的自我反饋回路放大，構(gòu)建了一個(gè)免疫級(jí)聯(lián)炎癥網(wǎng)絡(luò)[11]。Nrf2 是廣泛存在于小膠質(zhì)細(xì)胞中的多效轉(zhuǎn)錄因子。它是細(xì)胞氧化應(yīng)激的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，產(chǎn)生的抗氧化劑包括血紅素加氧酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶，最后可激活觸珠蛋白[15]。此外，Nrf2 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腦卒中和神經(jīng)退行性疾病中調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的重要靶點(diǎn)。Nrf2 可通過(guò)下調(diào)NF-κB 促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)化[16]。

紅曲素的主要成分為紅曲霉菌在水稻中發(fā)酵而成的黃色天然色素，是一種新型的Nrf2 激動(dòng)劑[16]，筆者之前的研究表明可抑制病理?xiàng)l件下的氧化應(yīng)激，促進(jìn)血腫吸收，減少腦水腫[9]。血脂康是以紅曲素為成分的中藥，以莫那霉素為主要成分的膽甾素提取物，主要用于抗動(dòng)脈粥樣硬化，并通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 發(fā)揮抗炎作用[17]。本研究結(jié)果顯示，兩者均促進(jìn)了Nrf2 的表達(dá)，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Trem1 和Trem2 是在骨髓細(xì)胞家族上表達(dá)的觸發(fā)受體的成員，主要通過(guò)識(shí)別外來(lái)抗原和有毒物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；大多數(shù)研究表明Trem1 可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而Trem2 可抑制炎癥反應(yīng)[18]；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，是腦出血后炎癥的關(guān)鍵調(diào)控因子。研究表明，抑制Trem1 的表達(dá)可以減少腦出血介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及減輕神經(jīng)功能缺陷[19]；而激活Trem2 的表達(dá)可清除或內(nèi)吞凋亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片，減輕小鼠腦出血后的神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元凋亡[20]，對(duì)神經(jīng)可塑性和髓鞘形成至關(guān)重要[21]。本結(jié)果顯示腦出血組的Trem1 上調(diào)，提示Trem1 與腦出血的神經(jīng)炎癥高度相關(guān)。在腦出血+Nrf2-/-組中，Trem1 表達(dá)上調(diào)，Trem2 表達(dá)下降，而Nrf2 激動(dòng)劑——紅曲素和血脂康可抑制Trem1、強(qiáng)化Trem2 的表達(dá)，提示紅曲素和血脂康通過(guò)上調(diào)Nrf2抑制Trem1 的神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)強(qiáng)化Trem2的表達(dá)；Trem2 作為抗炎因子可降低腦內(nèi)促炎因子的表達(dá)及由Trem1 引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，Trem2 的蛋白表達(dá)與改良Garcia 評(píng)分呈正相關(guān)，與血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Trem2 起到神經(jīng)保護(hù)作用，可能通過(guò)吞噬參與腦出血后血腫成分的清除。Trem2、BDNF 被認(rèn)為是神經(jīng)修復(fù)的必需物質(zhì)。研究結(jié)果表明Nrf2 可直接影響Trem1/Trem2 的表達(dá)變化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外紅曲素和血脂康可強(qiáng)化小膠質(zhì)細(xì)胞CD206 的表達(dá)；表面特異表達(dá)CD206 分子可吞噬損傷的神經(jīng)細(xì)胞碎片、促進(jìn)組織修復(fù)和神經(jīng)元再生，起抗炎和神經(jīng)修復(fù)作用。同時(shí)隨著小膠質(zhì)細(xì)胞向CD206 表型轉(zhuǎn)化，促炎因子TNF-α 降低，而神經(jīng)修復(fù)因子BDNF 增高。在腦出血+Nrf2-/-組中，小膠質(zhì)細(xì)胞CD206 表達(dá)下調(diào)，CD80 表達(dá)上調(diào)，提示Nrf2 可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)化。

綜上所述，Nrf2 可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)化，影響腦出血后血腫清除、水腫形成及神經(jīng)功能缺損；紅曲素、血脂康作為Nrf2 的激動(dòng)劑，通過(guò)上調(diào)Trem2、CD206、BDNF 的表達(dá)強(qiáng)化小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)血腫產(chǎn)物的清除并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)；同時(shí)下調(diào)Trem1 及CD80、TNF-α 的表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減輕出血后血紅蛋白含量及神經(jīng)毒性而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。該研究從機(jī)制水平探索Nrf2 在腦出血后血腫清除中的作用，為未來(lái)腦出血后血腫清除的臨床干預(yù)提供了全新的研究方向及思路。