Bobs技術在胎兒染色體異常產前診斷中的應用研究

鄢 一

（葫蘆島市中心醫院，遼寧 葫蘆島 125000）

傳統細胞遺傳學分析方式是進行產前診斷的金標準，這種分析方式不僅能夠明確染色體的具體狀況，還能明確其中的數目異常和大片段缺失的結構異常，但這種診斷方式需要進行細胞培養，在各項操作過程中步驟較多，想要對其進行完善的質量控制具有較大的難度[1]。也在臨床研究中發現這種診斷方式對于顯微鏡的要求較高，而目前來說我國應用的細胞遺傳診斷顯微鏡分辨率有限，無法檢測出小于5 Mb且具有臨床意義的染色體微缺失綜合征，在進行各項操作時具有較高的操作難度，需要專業人員進行分析[2]。近幾年新推出的細菌人工染色體標記微球陣列技術，能夠同時對臨床上最為常見的5種染色體非整倍體以及染色體微缺失癥進行診斷，在臨床上屬于一種特異性較高且高通量的快速產前診斷技術[3-5]。本次研究將2018年6月至2020年1月作為研究時段，在該時段內錄入葫蘆島市中心醫院中接受常規體檢的3 000例單胎中期妊娠產婦作為研究對象，探究將細菌人工染色體微球檢測技術應用于胎兒染色體異常產前診斷中的效果，分析其臨床可用性，現將結果方法總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2018年6月至2020年1月作為研究時段，在該時段內錄入葫蘆島市中心醫院中接受常規體檢的3 000例單胎中期妊娠產婦作為研究對象，所有產婦在入院時存在高齡、染色體家族史、超聲結構或軟指標異常、無創DNA檢測高風險等狀況。所有產婦的年齡信息區間介于23～32歲，平均年齡（28.40±3.70）歲，產婦孕周為18～21周，平均孕周（19.89±1.21）周。

納入標準：①所有患者在入院時基本資料納入研究并接受體征檢測，確認符合臨床疾病。②患者可耐受本次試驗中各項操作。③患者基本資料錄入數據庫后可接受調取。④患者自愿簽署知情同意書，研究內容符合我院倫理審查標準。

排除標準：①患者因主觀因素無法參與后續試驗或無法耐受試驗操作。②患者處于疾病恢復期或在接受試驗前3個月接受過其他試驗。③患者家屬不同意本次試驗。

將3 000例單胎中期妊娠產婦資料錄入Excel表格后進行資料綜合分析，葫蘆島市中心醫院統計學人員分析患者資料，確認患者資料可比其良好后錄入研究，無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 Bobs檢測 常規抽取羊水10 mL，對樣本進行離心處理，速度為2 000 r/min，離心處理5 min，去除生物氫液后，保留細胞對胎兒羊水細胞基因組DNA進行檢查，使用美國Qiagen公司生產的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取。確認樣本的DNA濃度與純度根據其具體狀況做好相應的標記和純化，使用美國Thermo公司生產的NAN DROP 2000測定樣本的濃度與純度。使用芬蘭Perkin Elmer公司生產的obsAssay試劑盒標記、純化基因組DNA。采用Bobs探針進行雜交，做好DNA洗滌，常規檢測雜交分子的熒光強度針對其中存在的問題，使用美國Luminex公司生產的Luminex200來測定雜交分子的熒光強度。應用計算機軟件（Bobsoft 2.0版）進行計算分析，生成結果數據后進行判斷。

Bobs檢測判定標準：正常比值為（1.00±0.02）。若大于正常比值，則為片段重復；若小于正常比值，則為片段缺失。

1.2.2 G顯帶染色體核型分析 取羊水樣本量20 mL，將其進行離心后接種放置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中進行連續7 d培養，對培養液進行更換后24 h進行收獲以及制片，G顯帶后核型分析。由我院中相關醫務人員對圖像進行檢測分析。分析以上細胞核型，計數大于（或等于）10個克隆分裂相，根據《人類細胞遺傳學命名的國際體制（ISCN）》標準2009（ISCN2009）診斷。

1.2.3 全基因組SNP微陣列檢測 應用因芯片（美國Affymetrix Genome CytoScan 750K）根據操作要求對DNA進行處理，包括DNA消化處理、擴增處理、純化、片段化處理、標記信號處理、雜交處理、洗片染色處理及掃描處理等。使用軟件（Chromosome Analysis Suite）來對數據進行分析與判定。

全基因組SNP微陣列檢測的判定標準：200 kb為拷貝數變異的報告閾值缺失；500 kb為片段重復。

1.3 觀察指標 對比分析染色體核型分析診斷、Bobs診斷、基因芯片診斷在胎兒染色體異常產前診斷中的效果。

1.4 統計學方法 本次試驗中3 000例單胎中期妊娠產婦統計數據由醫務人員進行記錄，將其錄入統計學軟件SPSS21.00 For Windows后進行整理分析，數據選擇χ2、t進行分析，確認計算結果P值與0.05關系，若P＜0.05則說明本次研究結果具有統計學意義，反之則統計學意義不存在。

2 結果

在本次研究結果中顯示，3 000例產婦中染色體核型分析檢出各類異常共219例，其中存在165例染色體非整倍體數目異常狀況（包含：21-三體、21-三體與精曲小管發育不全、18-三體、13-三體、45XO），染色體非整倍體數目異常狀況占比為75.34%；54例患者為染色體結構異常（包含：微缺失/微重復、易位、倒位、Bob易位、性染色體嵌合體），為染色體結構異常占比為24.64%。而在Bobs診斷結果中，其非整倍體數目異常診斷結果與G顯帶核型分析結果完全一致，出現4例漏診狀況，并且其診斷結果與基因芯片檢測結果一致。見表1。

表1 3種患者診斷準確率對比

3 討 論

嬰兒出生缺陷是指出生前發生的結構、功能或代謝異常。隨著二胎政策的開放，多數年齡較大的孕婦的數量不斷增加，胎兒出生缺陷的風險也不斷增加。據調查，我國每年約發生90萬例胎兒出生缺陷，這已成為一個重要的公共衛生問題。產前診斷是預防出生缺陷的主要措施。例如，產前超聲能及時、有效地檢測胎兒結構異常。染色體異常的篩選方法包括血清學篩選和非侵入性產前基因測試，產前診斷方法包括染色體核型分析、熒光原位雜交分析、染色體微陣列分析和細菌人工染色體標記-微球鑒別/分離測定。染色體核型分析是胎兒產前診斷染色體異常檢測的金標準[6]。

G顯帶染色體核型分析是目前臨床應用最為廣泛的人類染色體核型分析技術[7]，這種方式受到地域、標本年齡以及試驗條件等多因素的限制，導致核帶在處理過程中存在明顯差異，嚴重時可能導致培養失敗的情況，在一定程度上影響了結果的準確性。臨床研究發現[8]，大約有16%的病例在G顯帶染色體核型分析中未檢出異常，而其中大約有10%為胎兒多發性畸形。隨著近年來醫療環境的不斷改善，G顯帶染色體核型分析的改良版將高分辨率的方案應用于其中，這種方案能夠顯示出超過2 000條的染色體條帶，但這種檢驗方式對于檢驗人員提出了極高的要求，難以在臨床上推廣使用[9-10]。Bobs監測方案在應用過程中不僅操作簡單，對于各種診斷方式具有較高的診斷準確度，這種診斷技術對于探針覆蓋范圍內的微重復病例即可明顯檢出，同時這種檢測方式無須對樣本進行培養操作較為簡單，對于大多數醫務人員均有較好的適應度。

產前診斷是減少出生缺陷的有效方法，染色體核型分析可以發現染色體數目異常和大于5～10 Mb的結構異常，這是檢測產前診斷的“金標準”。由于與畸形或智力發育有關的微缺失和微重復的檢測能力有限，因此存在漏診的風險。

染色體微陣列分析技術包括基因芯片分析單核苷酸多態性和陣列比較基因組雜交，它不僅能檢測染色體非整倍體，還能檢測微缺失以及微重復。國內外指南建議在產前超聲顯示胎兒結構異常時，選擇染色體微陣列分析進行基因檢測。染色體核型分析結合嵌合體檢測對于產前診斷和合適的遺傳咨詢進行更全面、更準確的篩查具有重要意義。然而，該技術不僅可以檢測到染色體的異?？截悢担铱梢詸z測到染色體的異常拷貝數，這使得結果的解釋更加困難和昂貴，對孕產婦的經濟壓力更大。產前Bobs技術的應用彌補了傳統染色體核型分析的不足，報告周期短，結果清晰易讀，在快速產前診斷方面具有明顯的優勢。

雖然Bobs診斷方式具有一定的瓶頸性[11-12]，無法檢測多倍體，同時對于低比例的染色體異常嵌合檢出能力存在一定的限制，但總體來說依舊屬于一種高效且快速的產前診斷方式，為了避免這種診斷方式的瓶頸性，可以在臨床上將其與G顯帶染色體核型分析應用于患者的診斷中，能夠起到互補的效果，這樣能夠提高產前診斷染色體非準備數目異常的檢出率，對于優生優育率的提升來說效果良好[13]。

Bobs診斷的主要優勢為準確度、特異度和靈敏度較高，基因芯片在染色體微缺失、微重復方面的診斷中效果突出。該方法是一種基于微珠的多重檢測方法，目標區域代表位點，與現有的快速產前診斷檢測方法相比具有更大的疾病覆蓋率[14]。

綜上所述，Bobs診斷方式應用于胎兒染色體非整倍體異常診斷中能夠快速明確胎兒的異常狀況，其研究結果與G顯帶染色體核型分析與基因芯片檢測相似度較高，這種診斷方式診斷準確率較高，并且診斷迅速，能夠早期明確胎兒的妊娠狀況，對于終止妊娠和后續治療工作的開展來說有積極意義，值得推廣。