全反式維甲酸與胃癌預(yù)后相關(guān)性及其機(jī)制研究

馮振游, 胡孔旺 , 丁慧明, 黃志國(guó)

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，合肥 230022

胃癌(gastric carcinoma，GC)是發(fā)病率最高的腫瘤之一。大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期。研究[1]表明，胃癌細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。課題組前期試驗(yàn)表明，全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)會(huì)提高胃癌患者的生存率。ATRA屬于維生素A的一種，其相對(duì)分子量大小為300.44。ATRA對(duì)于人體的生長(zhǎng)發(fā)育以及細(xì)胞的分化起到了重要的作用。已經(jīng)有相關(guān)研究[2]證明，ATRA與受體RARRa/RXR 結(jié)合后，對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡等產(chǎn)生了一定的抑制作用。如ATRA與受體 RARα 結(jié)合后可誘導(dǎo)神經(jīng)母瘤細(xì)胞分化，與RARβ結(jié)合后則使其生長(zhǎng)受到抑制[3]。ATRA在臨床中已經(jīng)被用作細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，對(duì)于多種腫瘤均存在治療效果。因此，該實(shí)驗(yàn)探討了ATRA對(duì)胃癌術(shù)后患者預(yù)后的影響，以及ATRA參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料2001年5月—2012年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科就診，并且病理組織學(xué)診斷為胃癌組織浸潤(rùn)到黏膜下層以下的胃癌患者，外周血常規(guī)檢查、肝腎功能和血脂檢測(cè)指標(biāo)均正常，美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組(Eastern cooperative oncology group，ECOG)體力狀態(tài)評(píng)分4分以下。

1.2 治療方法按照均衡循序隨機(jī)的方法將入選胃癌患者于手術(shù)后分為對(duì)照組和ATRA組。其中對(duì)照組對(duì)患者進(jìn)行靜脈輔助化療的方式，具體為患者采用FLP[5-Fu 400 mg/m2×5 d，DDP 60 mg/m2×1次，亞葉酸鈣每天200 mg/m2×5 d] 方案，3周為一個(gè)化療周期，共計(jì)6個(gè)療程。ATRA組患者為靜脈輔助化療+口服ATRA的方式，口服ATRA具體為手術(shù)后2 d開始服用ATRA，10 mg/次，3 次/d，共計(jì)6個(gè)月。上述研究方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的知情同意。

1.3 隨訪通過(guò)當(dāng)?shù)匦姓芾砣藛T、社區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)人員及患者或家屬電話聯(lián)系隨訪，了解患者是否生存或患者的死亡時(shí)間。隨訪截止到2020年10月，248例患者中198例獲得隨訪。其中ATRA組98例，對(duì)照組100例。

1.4 細(xì)胞株及主要試劑胃癌 MGC-803 細(xì)胞購(gòu)自上海冠道生物科技有限公司；全反式維甲酸購(gòu)自美國(guó)sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技有限公司；胰酶購(gòu)自武漢金開瑞科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自上海江林生物科技有限公司；DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自合肥欣樂生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，快速凝膠試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾科技有限公司；E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPHD一抗和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自合肥欣樂生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒和熒光二抗購(gòu)自武漢賽維爾科技有限公司公司； Western-blot凝膠和板均購(gòu)自康樂有限公司。熒光定量PCR儀器購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。ATRA購(gòu)自山東良福制藥有限公司。亞葉酸鈣購(gòu)自連云港伊特諾化工科技有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 胃癌 MGC-803 細(xì)胞使用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱參數(shù)為37 ℃、5% CO2。胎牛血清的濃度為10%。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每2 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。將培養(yǎng)好的胃癌 MGC-803 細(xì)胞分為對(duì)照組和ATRA組。ATRA組中用30 μmol/L ATRA溶液進(jìn)行處理。對(duì)照組不進(jìn)行ATRA溶液處理。

1.5.2CCK-8法檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，常規(guī)消化，將其接種到96孔板中，96孔板中每個(gè)孔中細(xì)胞懸液量為100 μl，細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)/孔，每組設(shè)置3次重復(fù)組。將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，參數(shù)設(shè)置為37 ℃、5% CO2。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，更換不同濃度的ATRA培養(yǎng) (10、25、50、75和100 μmol/L)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和DMSO組。ATRA溶液分別處理24 h和48 h后，加入CCK-8試劑，在酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)的吸光度。

1.5.3細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞的遷移能力 當(dāng)6孔板中胃癌 MGC-803 細(xì)胞的細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔時(shí)，此時(shí)加入不含有胎牛血清的培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用1 ml的槍頭全部沿著同一個(gè)方向進(jìn)行直線劃線，之后每孔中的細(xì)胞使用PBS進(jìn)行洗滌，加入含有1%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用相機(jī)拍攝顯微鏡中細(xì)胞遷移的照片。

1.5.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲能力 基底膜進(jìn)行預(yù)冷處理，使用不含胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋。基底膜放置在Transwell的板上室，將整個(gè)聚碳脂膜全部覆蓋。將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中1 h待其形成穩(wěn)定的凝膠。在下面加入700 μl DMEM低糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清。在上室孔中加入無(wú)血清的細(xì)胞懸液，密度為2×105個(gè)/孔。分別設(shè)置對(duì)照組和ATRA組，培養(yǎng)36 h后，用甲醇溶液固定胃癌 MGC-803 細(xì)胞，加入0.1%的結(jié)晶紫染色液染色20 min，用PBS洗滌3次，放在顯微鏡下用相機(jī)拍照。

1.5.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞的凋亡水平 收集對(duì)照組和ATRA組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集，室溫下2 000 r/min離心5 min，用4 ℃的PBS重懸細(xì)胞，室溫下2 000 r/min離心5 min，棄上清液洗滌細(xì)胞。加入300 μl的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避免室溫孵育15 min，加入5 μl的PI染色，200 μl的1×Binding Buffer，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.5.6Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平 收集對(duì)照組和ATRA組細(xì)胞，使用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解，離心機(jī)參數(shù)設(shè)置為12 000 r/min，離心時(shí)間15 min。收集胃癌 MGC-803 細(xì)胞的上清液存儲(chǔ)于1 ml離心管中。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品20 μg加入上樣緩沖液(5×)100 ℃加熱10 min。將制得的樣品分別加入8% SDS-PAGE和12% SDS-PAGE凝膠中。電泳條件為電壓120V，電泳時(shí)間30 min。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時(shí)停止電泳，使用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，使用BSA溶液在室溫的條件下進(jìn)行封閉1 h。分別加入一抗E-cadherin(1 ∶2 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、Vimentin(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)，在4 ℃冰箱中孵育12 h。使用TBST溶液洗滌3次，每次洗滌10 min。使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊兔抗體IgG(1 ∶5 000)在室溫的條件下進(jìn)行孵育1 h。使用TBST溶液洗滌3次，每次洗滌10 min。加入顯色液后使用BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察不同分組的蛋白灰度值，使用Image J 軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.7RT-qPCR法檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)水平 選擇生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～90%之間的胃癌 MGC-803 細(xì)胞，丟棄培養(yǎng)基后使用PBS溶液洗滌2～3次。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1 ml TRIzol試劑，冰上靜止10 min后使用200 μl移液槍進(jìn)行吹打。將裂解液全部轉(zhuǎn)移至2 ml的EP管中。TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后用IDTE緩沖液( pH = 8.0，Integrated DNA Technologies，美國(guó))稀釋至10 ng /μl。qPCR反應(yīng)體系；25 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ，20 ng cDNA和上下游引物共40 μmol/L, dd H2O補(bǔ)充至50 μl。依據(jù)RT-qPCR說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 45s，70 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各基因引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

1.5.8免疫熒光檢測(cè)胃癌MGC-803細(xì)胞標(biāo)記蛋白N-cadherin，E-cadherin和Vimentin的表達(dá) 將處理后的胃癌細(xì)胞以1×104個(gè)/皿接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)24 h。將FBS進(jìn)行更換，使用PBS溶液將細(xì)胞培養(yǎng)基洗去，同時(shí)使用多聚甲醛將細(xì)胞固定30 min，用PBS緩沖液輕輕晃洗4次后吹干，使用1%的曲通進(jìn)行細(xì)胞膜的裂解，使用PBS緩沖液洗去曲通，100 mmol甘氨酸進(jìn)行封閉，再使用PBS緩沖液進(jìn)行清洗，每次10 min共3次。5% BSA封閉1 h后加入N-cadherin，E-cadherin和Vimentin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，使用TBST緩沖液進(jìn)行清洗，每次10 min共3次，室溫避光孵育熒光二抗1 h，使用TBST緩沖液進(jìn)行清洗，每次10 min共3次。加入細(xì)胞核染液DAPI室溫孵育10 min，使用TBST緩沖液進(jìn)行清洗，每次10 min共3次，用超純水清洗2次，加入適量的抗淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下分析樣本并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 基線數(shù)據(jù)兩組性別、TNM分期、分化程度和手術(shù)方式等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體見表2。

2.2 ATRA治療延長(zhǎng)胃癌患者的生存時(shí)間對(duì)198例GC患者進(jìn)行術(shù)后隨訪， Kaplan-Meier的生存分析結(jié)果顯示，ATRA組的GC患者生存期高于對(duì)照組的GC患者(P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

2.3 ATRA抑制胃癌 MGC-803細(xì)胞的增殖能力不同濃度的ATRA溶液處理胃癌MGC-80細(xì)胞24、48 h后，CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比， ATRA處理的胃癌MGC-803細(xì)胞增殖能力降低(P<0.01)，且隨著濃度的增大增殖能力不斷下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

表2 兩組基線數(shù)據(jù)(n)

圖1 Kaplan-Meier分析兩組胃癌術(shù)后患者的生存時(shí)間

圖2 不同濃度的ATRA對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

2.4 ATRA抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的遷移能力30 μmol/L ATRA溶液處理胃癌 MGC-803 細(xì)胞 24、48 h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATRA組的胃癌 MGC-803 細(xì)胞遷移率下降(F=41.718，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATRA抑制胃癌MGC-803細(xì)胞遷移能力 ×200

2.5 ATRA抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的侵襲能力ATRA組中加入30 μmol/L ATRA溶液，培養(yǎng)36 h后與對(duì)照組相比，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATRA組的胃癌 MGC-803 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量小于對(duì)照組(F=36.098，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.6 ATRA誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞的凋亡ATRA組30 μmol/L ATRA溶液作用24 h和48 h后，與對(duì)照組相比， ATRA處理后的胃癌 MGC-803 細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

2.7 ATRA上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)水平ATRA組30 μmol/L ATRA溶液處理細(xì)胞24、48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ATRA組的胃癌 MGC-803 細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平上升(F=118.022，P<0.01)，且隨著時(shí)間的增加表達(dá)水平上升。N-cadherin(F=149，P<0.01)和Vimentin(F=180，P<0.01)表達(dá)水平下降，且隨著時(shí)間的增加表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATRA抑制胃癌MGC-803

2.8 ATRA上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Vimentin mRNA表達(dá)水平和對(duì)照組相比，ATRA組經(jīng)過(guò) 30 μmol/L ATRA溶液處理24、48 h后。E-cadherin mRNA表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Vimentin、N-cadherin mRNA表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表3。

表3 ATRA上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Vimentin mRNA表達(dá)水平

2.9 ATRA增強(qiáng)E-cadherin熒光強(qiáng)度，降低Vimentin 和N-cadherin熒光強(qiáng)度ATRA組30 μmol/L ATRA溶液作用24 h和48 h后，和對(duì)照組相比，免疫結(jié)果表明，ATRA增強(qiáng)E-cadherin熒光強(qiáng)度，降低N-cadherin、Vimentin熒光強(qiáng)度(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATRA促進(jìn)胃癌 MGC-803 細(xì)胞凋亡

圖6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATRA對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

圖7 ATRA影響E-cadherin，Vimentin 和N-cadherin的熒光強(qiáng)度 ×200

3 討論

在目前已知的腫瘤中，GC是發(fā)病率較高的一種，且發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)報(bào)道[4]，我國(guó)2019年GC患者數(shù)量就已經(jīng)超過(guò)了110萬(wàn)例。由于國(guó)內(nèi)的飲食習(xí)慣存在一定的差異，導(dǎo)致GC發(fā)病率是其他國(guó)家的兩倍以上[5]。目前對(duì)于GC的治療主要有藥物，手術(shù)化療等方式。術(shù)后GC患者的預(yù)后較差，5年的生存率僅為35%[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)治療中加入ATRA可改善胃異型增生患者的預(yù)后。Rb蛋白的定量可以作為腫瘤轉(zhuǎn)陰的標(biāo)記物，經(jīng)過(guò)ATRA處理后的樣本顯示Rb水平升高，這可能有助于抑制胃異型增生。

實(shí)驗(yàn)證明，ATRA可以通過(guò)抑制GC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，從而抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等。EMT是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在進(jìn)行分化時(shí)所存在的一種過(guò)程。因此EMT對(duì)于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程存在顯著的作用。研究EMT顯示，此過(guò)程中出現(xiàn)較多的標(biāo)志性蛋白表達(dá)量的改變，例如E-cadherin表達(dá)下降， N-cadherin和Vimentin表達(dá)增高等。如果抑制此過(guò)程，相關(guān)蛋白的表達(dá)量會(huì)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。探究ATRA對(duì)GC細(xì)胞EMT的影響中顯示，ATRA組的E-cadherin蛋白表達(dá)量增多，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量下降，這和預(yù)期結(jié)果一致。EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的黏附性降低，同時(shí)伴有大量細(xì)胞因子分泌，從而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。已經(jīng)有相關(guān)實(shí)驗(yàn)[8]表明，EMT對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲過(guò)程具有增強(qiáng)作用。且研究[9]發(fā)現(xiàn)，GC細(xì)胞中已經(jīng)明確存在EMT。ATRA屬于維生素A的中間代謝產(chǎn)物，是一種新型的細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑，對(duì)腫瘤細(xì)胞有著明顯的抑制效果。ATRA可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，在臨床中應(yīng)用較為廣泛。在宮頸癌、甲狀腺癌患者的治療中，口服ATRA的治療作用和預(yù)防效果較為顯著[10]。前期研究[11]已經(jīng)證明，ATRA治療GC具有一定的療效，且在一些腫瘤細(xì)胞株中ATRA可以增強(qiáng)順鉑的治療作用[12]。ATRA聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu) 或順鉑腹腔灌注治療GC有較好的臨床療效。

本研究中以198例GC患者為研究對(duì)象，結(jié)果表明，ATRA治療的GC術(shù)后患者生存期大于未進(jìn)行ATRA治療的患者。因此ATRA聯(lián)合化療治療的方式可以延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。ATRA可以抑制GC MGC-803 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)GC細(xì)胞的凋亡。經(jīng)過(guò)ATRA處理后，EMT相關(guān)基因(N-cadherin、Vimentin)表達(dá)水平下降，E-cadherin表達(dá)水平上升。