大麻二酚上調BDNF、突觸蛋白發揮抗抑郁作用

楊 艷，馬滕滕，邊宇婧，顧江娜，孫毓媛，溫朕勇，謝建平，袁 云,郭 英

作者單位：1昆明醫科大學基礎醫學院，昆明 6500002云南民族大學圖書館，昆明 650000

抑郁癥表現為長期心理和生理的低迷狀態。全球范圍內有3.22億人患有抑郁癥，約占世界人口的4.4%[1]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是藥用大麻的主要化學成分之一，無致幻和成癮性，具有改善疼痛、失眠、成癮和焦慮等癥狀的藥理作用[2]，但其醫用價值尚未被完全開發。CBD可通過調節多種與抑郁癥相關的神經遞質系統發揮抗抑郁作用[3]，但具體調節哪些與抑郁癥治療相關因子發揮作用，已成為研究者新的關注點。該研究以慢性束縛復制小鼠抑郁模型，通過觀察小鼠行為學表現，檢測血清中腦源神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、突觸后密度-95蛋白(postsynaptic density protein 95，PSD-95)、突觸素(synaptophysin，SYP)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)的變化，探究CBD緩解小鼠抑郁癥狀的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器大麻二酚(衡水昊業化工科技有限公司，批號：20191019)；舍曲林(大連輝瑞制藥有限公司, 批號：H10980141)；吐溫-80(德國BioFroxx公司,批號：20190422)；小鼠BDNF、PSD-95、SYP、mTOR 酶聯免疫吸附測定試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號：20201222-20520A、20201222-22168A、20201222-22084A、20201222-21729A)。多功能酶標儀、低溫高速離心機(美國 Thermo Fisher Scientific)；高速勻漿儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物4周齡SPF級ICR小鼠45只，雄性，體質量20～25 g，購于昆明醫科大學實驗動物學部，生產許可證號：SCXK (滇)K2020-0004。使用正常小鼠飼料飼喂養，飼料購于昆明醫科大學實驗動物學部；所有實驗動物均飼養于(23±2) ℃的恒溫恒濕室內，整個實驗期間室內通風條件良好，12 h明暗交替。

1.3 方法

1.3.1抑郁樣小鼠模型的建立及分組 45只小鼠適應性飼養5 d，曠場實驗后，分為5組，每組9只，正常對照組正常進食進水。其余各組以慢性束縛應激復制抑郁模型，具體方法如下：將小鼠置于前后開口的50 ml離心管，前端有12個直徑0.5 mm的小孔，水平放置后禁錮12 h(21:00-次日9:00)，保證通風良好，連續7 d，禁錮時小鼠在同一環境中，不予進食進水。

分組及灌胃處理情況如下：正常對照組和模型組給予2%的吐溫-80水溶液，陽性對照組給予10 mg/kg舍曲林，CBD低劑量組給予25 mg/kg CBD，CBD高劑量組給予50 mg/kg CBD，溶劑均為2%的吐溫-80水溶液。按10 ml/kg體積進行灌胃，在每只小鼠行為學實驗前1 h進行。

1.3.2行為學實驗

1.3.2.1曠場實驗 將小鼠放在50 cm×50 cm的曠場內進行自由活動和探索。SMART 3.0軟件觀察記錄小鼠在曠場內6 min的活動總路程，同時記錄小鼠在曠場中央30 cm×30 cm區域中活動的路程和時間，并分析占曠場的總路程、總時間的百分比。

1.3.2.2強迫游泳實驗 將小鼠放在直徑18 cm、水溫(25±2) ℃、深20 cm的玻璃缸中強迫游泳，觀察8 min，SMART 3.0軟件記錄小鼠后6 min不動時間，并分析小鼠的不動時間占總時間的百分比。

1.3.3生化指標檢測

1.3.3.1樣本采集及制備 行為學實驗結束后，各組小鼠心尖取血，處死小鼠取腦置于冰上，迅速取出海馬和前額皮層，放入離心管中置于-80 ℃保存備用。以質量比1 ∶9的比例加入PBS溶液，用勻漿機將標本勻漿充分，12 000 r/min離心15 min，取上清液于4 ℃保存備用。

1.3.3.2ELISA方法進行相關指標測定 設置兩組標準品孔和空白對照孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl，每孔加入酶標試劑100 μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。洗滌液洗滌5次后拍干。每孔先后加入顯色劑A和顯色劑B各50 μl，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液50 μl。以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(optical density, OD)。以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。標準曲線方程式分別為：yBDNF=0.0034x+0.1095(R2=0.9982)、yPSD-95=0.117x+0.0956(R2=0.9989)、ySYP=0.0652x+0.0865(R2=0.9976)、ymTOR=0.0553x+0.0833(R2=0.9998)。

2 結果

2.1 CBD對抑郁樣小鼠曠場實驗的影響由表1可知，與正常對照組對比，模型組在中央區域活動路程百分比、中央區域活動時間百分比和總路程均明顯降低(F=3.522、2.841、2.110,P<0.05)。與模型組相比，CBD低劑量組在中央區域活動路程百分比、中央區域活動時間百分比和總路程均明顯升高(P<0.05)。各組小鼠曠場實驗活動軌跡見圖1。以上結果表明CBD對應激小鼠有明顯的抗焦慮作用，并且使小鼠的自發行為也明顯增加。

2.2 CBD對抑郁樣小鼠強迫游泳實驗的影響由表2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠的不動時間百分比明顯增大(F=3.772,P<0.01)。與模型組相比，CBD低劑量組和陽性對照組不動時間百分比均降低(P<0.05)。以上結果表明CBD對抑郁樣小鼠有明顯的抗抑郁作用。

表1 CBD對抑郁樣小鼠曠場實驗的影響

圖1 CBD對抑郁樣小鼠曠場實驗活動軌跡的影響

表2 CBD對抑郁樣小鼠強迫游泳實驗的影響

2.3 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中BDNF濃度的影響由圖2可知，在前額皮層，與正常對照組相比，模型組BDNF濃度明顯下降(F=2.805,P<0.05)。與模型組相比，CBD低劑量組BDNF濃度明顯增高(P<0.01)。在海馬組織中，各組之間BDNF濃度均無明顯差異。以上結果表明CBD能增加抑郁樣小鼠前額皮層BDNF的濃度。

圖2 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中 BDNF 濃度的影響

2.4 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中PSD-95 濃度的影響由圖3可知，在前額皮層，與正常對照組相比，模型組PSD-95濃度明顯下降(F=8.401,P<0.01)。與模型組相比，CBD低劑量組(P<0.05)和陽性對照組(P<0.01)PSD-95濃度均明顯增高，而CBD高劑量組PSD-95濃度有增高趨勢(P=0.075)。在海馬組織中，各組之間PSD-95濃度均無明顯差異。以上結果表明CBD能增加抑郁樣小鼠前額皮層PSD-95的濃度。

2.5 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中SYP濃度的影響由圖4可知，與正常對照組相比，模型組SYP濃度在海馬中明顯下降(F=9.523,P<0.01)。與模型組相比，CBD低劑量組、CBD高劑量組和陽性對照組在海馬中SYP濃度均明顯增高(P<0.01)。前額皮層中，與模型組相比，CBD低劑量組SYP濃度增高(F=7.824，P<0.05)。以上結果表明CBD能增加抑郁樣小鼠海馬和前額皮層SYP的濃度。

圖3 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中PSD-95 濃度的影響

圖4 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中SYP濃度的影響

2.6 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中mTOR濃度的影響由圖5可知，在海馬區域，與正常對照組相比，模型組mTOR濃度明顯下降(F=13.013,P<0.01)。與模型組相比，CBD低劑量組、高劑量組和陽性對照組mTOR濃度均明顯上升(P<0.01)。在前額皮層區域，與正常對照組相比，模型組mTOR濃度降低(F=2.888,P<0.05)。與模型組相比，CBD低劑量組mTOR明顯增高(P<0.01)。以上結果表明CBD能增加抑郁樣小鼠海馬和前額皮層mTOR的濃度。

圖5 CBD對抑郁樣小鼠海馬和前額皮層中 mTOR濃度的影響

3 討論

抑郁癥是遺傳、生理、環境等諸多因素參與的精神疾病，發病機制尚不清楚。神經營養缺乏假說認為，抑郁狀態下，前額葉皮層和邊緣系統萎縮，神經營養因子含量明顯減少。CBD作為大麻中不具有精神活性和藥物依賴性的成分,安全性相對高，已有較多在神經疾病，如癲癇、阿爾茲海默癥、帕金森、焦慮癥等方面的研究，但在抗抑郁作用及機制的研究還較少。

本實驗使用舍曲林這一抗抑郁藥物作為陽性對照，它已被證明可提高突觸蛋白水平并促進海馬神經元的樹突生長[4]。BDNF參與神經可塑性和對應激性神經損傷的修復，其水平的調節已被證明在抑郁癥的發病、治療中發揮重要作用[5]。PSD-95和SYP是突觸的特異性標志物。本實驗結果表明：① CBD能快速改善抑郁樣小鼠的行為學表現；② CBD能快速上調抑郁樣小鼠前額皮層中BDNF、PSD-95水平，及前額皮層與海馬中SYP、mTOR水平表達。可見，CBD作用于抑郁樣小鼠的積極作用與突觸可塑性變化有關[6]。抑郁調控與mTOR 信號通路聯系密切。有研究[7]發現，慢性不可預測性應激可誘導大鼠抑郁樣行為，降低海馬中mTOR信號活性。CBD可通過背側海馬中BDNF-TrkB-mTOR通路的激活從而發揮抗抑郁作用[8]，同時抑郁樣小鼠內側前額皮質的突觸可塑性改變也與此有關[9]。本實驗仍有局限之處，出于給藥時間和劑量的考慮，本實驗未進行小鼠腦的形態學檢測。但可以明確的是，CBD可快速改善應激小鼠的抑郁樣行為，且此作用與海馬或前額皮層中BDNF、突觸蛋白水平上調有關。