酒輕飲對(duì)模型生物解酒護(hù)肝和胃腸 保護(hù)作用的研究

岳林濤，李 英，張永杰，魏 芳，李 艷，李安平

（1.山西振東五和醫(yī)養(yǎng)堂股份有限公司，山西長(zhǎng)治 046000；2.山西振東制藥股份有限公司，山西長(zhǎng)治 046000）

酒，是由一些發(fā)酵微生物發(fā)酵糖類(lèi)制成的一種飲料。其主要成分是乙醇[1]。白酒中含有多種風(fēng)味化合物，包括酯類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、萜烯類(lèi)及含硫化合物等[2]。飲酒的關(guān)鍵是量的把握。酒帶來(lái)的危害主要?dú)w因于酒精代謝中乙醛的產(chǎn)生，酒精在體內(nèi)的代謝過(guò)程中，大部分酒精是在肝臟中被酶分解代謝[3]。科學(xué)研究表明，短期大量攝入酒精易導(dǎo)致急性酒精中毒，長(zhǎng)期酗酒則會(huì)導(dǎo)致慢性酒精中毒，引起酒精性肝損傷，輕則酒精性脂肪肝，重則肝硬化、肝細(xì)胞癌、甚至死亡[4]。

我國(guó)飲酒歷史長(zhǎng)久，對(duì)應(yīng)的也有很多解酒護(hù)肝的中藥材。桑椹味甘、酸，性寒，歸肝、腎經(jīng)；且《本草綱目》中記載桑椹具有“搗汁飲，解酒中毒；釀酒服，利水氣，消腫”的功效[5]。枸杞子味甘、性平，歸肝、腎經(jīng)[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、保肝明目等藥理活性[7]。葛根性涼，味甘辛，歸脾、胃、肺經(jīng)，有解表退熱、升陽(yáng)止瀉及解酒之功效，具有神經(jīng)保護(hù)和解酒護(hù)肝等作用；枳椇子有止渴除煩、利尿解酒之功效[8-9]。代謝組學(xué)闡明枳椇子通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等代謝通路預(yù)防腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良（Adrenoleukodystrophy，ALD）[9-10]。上述原料配伍組合菊花、甘草及蜂蜜，各原料協(xié)同增效，既能緩解醉酒癥狀，又能保護(hù)胃腸道和肝臟等。以上述藥食同源中草藥為主要原料，經(jīng)過(guò)提取濃縮口味調(diào)整配制成一種植物飲料，對(duì)其功效進(jìn)行 驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物模型常用嚙齒動(dòng)物，如昆明小鼠、SD大鼠等[11]。而近年來(lái)，因與人類(lèi)基因同源性高（87%）、易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作等特點(diǎn)，斑馬魚(yú)成為了一種公認(rèn)的新型模式生物[12]。斑馬魚(yú)體小、生殖周期短、繁殖力強(qiáng)、易飼養(yǎng)、發(fā)育快和成本低，是大鼠的 1/1000；對(duì)DMSO耐受，易通過(guò)皮膚和腔道吸收藥物，最大限度地保留了在體活體的系統(tǒng)性[13]。與傳統(tǒng)小鼠實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)相比較，使用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行功效評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)周期縮短，克服了在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度大、周期較長(zhǎng)、存在個(gè)體差異的缺陷，兼顧了在體動(dòng)物模型近似人的整體生物反應(yīng)，已被國(guó)內(nèi)學(xué)者廣泛 接受[13]。

1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠

選 用KM小 鼠150只，SPF級(jí)，雄 性，體 重17～20 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證編號(hào)：SCXK(陜)2018-001，批號(hào)：20210419， 質(zhì)量合格證編號(hào)NO.1431。

1.2 斑馬魚(yú)

轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光斑馬魚(yú)，年齡為受精后3 d（3dpf），用于胃腸道黏膜保護(hù)作用評(píng)價(jià)的最大檢測(cè)濃度，即最小中毒濃度（Minimum Toxic Concentration，MTC）測(cè)定及其作用評(píng)價(jià)；野生型AB品系斑馬魚(yú)，年齡為受精后3 d（3 dpf），用于酒輕飲ALT活力降低作用評(píng)價(jià)最大檢測(cè)濃度（MTC）測(cè)定及其作用評(píng)價(jià)；年齡為受精后5 d（5 dpf），用于酒輕飲解酒作用最大檢測(cè)濃度（MTC）測(cè)定及其作用評(píng)價(jià)。

斑馬魚(yú)以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，每實(shí)驗(yàn)組為30尾，均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚(yú)用水中，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚(yú)中心繁殖提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證（001458）的要求[14]。

2 試劑與設(shè)備

試劑：AST、ALT測(cè)試盒（批號(hào)：20210121、20210122，南京建成）；潑尼松（批號(hào)C10016501，上海麥克林）；“RU21”（批號(hào)：25747，美國(guó)精神科學(xué)）；美他多辛（批號(hào)200401，浙江震元制藥）；三 硝 基 苯 磺 酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid，TNBS，批號(hào)：SLBT1675，Sigma）；無(wú)水乙醇（批號(hào)為20200825，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑）。

設(shè)備：旋渦混合儀（常州市萬(wàn)科豐儀器，XH-T）； 臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)，TDZ5-WS）；精密電子天平（CP214，OHAUS）；CCD相機(jī) （VertA1，上海土森視覺(jué)科技）；行為分析儀（ZebraLab3.11， ViewPoint）；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon）；多功能酶標(biāo)儀（SPARK，TECAN，Switzerland）； 體視顯微鏡（SZX7，OLYMPUS）。

3 功效實(shí)驗(yàn)

3.1 小鼠實(shí)驗(yàn)

小鼠分為5組，分別為正常組，模型組，低、中、高劑量組（2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg），按相應(yīng)劑量灌胃30 d，末次給藥后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。酗酒模型在預(yù)防性給藥7 d后，每天給酒給藥，酒灌胃量14 mL/kg bw。測(cè)定小鼠的質(zhì)量，觀察動(dòng)物的皮膚毛發(fā)、情緒反應(yīng)、行為狀態(tài)、活躍情況等。測(cè)前禁食16 h，按要求測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

3.1.1 肝臟質(zhì)量指數(shù)

稱(chēng)量小鼠空腹體重及肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟質(zhì)量指數(shù)。

3.1.2 生化指標(biāo)測(cè)定

末次給藥結(jié)束后，各組小鼠眼球取血，制備血清，依照AST、ALT測(cè)試盒說(shuō)明方法進(jìn)行測(cè)定。

3.1.3 解酒醒酒實(shí)驗(yàn)

解酒：給藥30 min后，每只小鼠灌胃給予56度紅星二鍋頭14 mL/kg。醒酒：給酒30 min后，每只小鼠灌胃受試物。各自觀察并記錄從第1次給酒至翻轉(zhuǎn)反射消失及恢復(fù)的時(shí)間。正常組按實(shí)驗(yàn)先后順序灌胃二鍋頭及等量生理鹽水。翻轉(zhuǎn)時(shí)間：灌酒完成至翻正反射消失的時(shí)間；恢復(fù)時(shí)間：翻正反射消失至翻正反射再次出現(xiàn)的時(shí)間。

3.2 斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)

3.2.1 胃腸黏膜保護(hù)作用評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取360尾3 dpf轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚(yú)。除正常組外，其余各實(shí)驗(yàn)組均水溶給予TNBS建立斑馬魚(yú)胃腸黏膜損傷模型。28 ℃處理2 d后，移除TNBS，分別水溶給予酒輕飲3.91 μL/mL、 7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、 125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1000 μL/mL濃度，陽(yáng)性組潑尼松15.0 μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置模型組和正常組（養(yǎng)魚(yú)用水處理），每孔容量為3 mL。處理結(jié)束后，觀察統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)的死亡數(shù)量和毒性反應(yīng)情況，確定酒輕飲的MTC；取MTC及以下共3個(gè)濃度組：陽(yáng)性組、模型組和正常組，每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)在熒光顯微鏡下拍照并保存圖片，用NIS-Elements D3.20高級(jí)圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚(yú)腸腔面積（A），以腸腔面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)酒輕飲胃腸道黏膜保護(hù)作用。在拍攝分辨率及相關(guān)參數(shù)相同情況下，像素點(diǎn)越多，面積越大，故用像素作為單位，不再計(jì)算實(shí)際面積。

3.2.2 解酒作用評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取360尾5 dpf野生型AB品系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚(yú)，水溶給予無(wú)水乙醇建立斑馬魚(yú)興奮期醉酒模型。分別水溶給予酒輕飲3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1000 μL/mL濃 度，陽(yáng) 性 組“RU21” 100 μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置模型組和正常組（養(yǎng)魚(yú)用水處理斑馬魚(yú)），每孔容量為3 mL。處理結(jié)束后，觀察統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)的死亡數(shù)量和毒性反應(yīng)情況，確定酒輕飲的MTC；取MTC及以下共3個(gè)濃度組、陽(yáng)性組、正常組和模型組，每組隨機(jī)選取12尾斑馬魚(yú)，用行為分析儀軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離（S），以總運(yùn)動(dòng)距離的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)酒輕飲解酒作用。

3.2.3 ALT活力降低作用評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取360尾3 dpf野生型AB品系斑馬魚(yú)于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚(yú)。分別水溶給予酒輕飲3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、 31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1000 μL/mL濃度，陽(yáng)性組美他多辛149 μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置模型組和正常組（養(yǎng)魚(yú)用水處理斑馬魚(yú)），每孔容量為3 mL。除正常組外，其余各實(shí)驗(yàn)組均水溶給予無(wú)水乙醇建立斑馬魚(yú)酒精性肝損傷模型。處理結(jié)束后，觀察統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)的死亡數(shù)量和毒性反應(yīng)情況，確定酒輕飲的MTC；取MTC及以下共3個(gè)濃度組、陽(yáng)性組、模型組和正常組，用ALT試劑盒通過(guò)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)斑馬魚(yú)體內(nèi)ALT活力（H），以ALT活力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)酒輕飲ALT活力降低作用。

3.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SE表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。①肝臟指數(shù)。模型組與正常組比較存在顯著性差異。劑量組與模型組比較，中劑量組存在差異性，低、高劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②ALT、AST活性。模型組與正常組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③解酒醒酒。劑量組與正常組比較，高劑量組解酒恢復(fù)時(shí)間和中、高劑量組醒酒恢復(fù)時(shí)間存在差異性。

表1 小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2 斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2.1 MTC

由表2可知，在胃腸道黏膜保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，酒輕飲濃度達(dá)到62.5 μL/mL時(shí)，斑馬魚(yú)并未出現(xiàn)明顯異常，高于此濃度后，死亡率直線上升；在解酒作用實(shí)驗(yàn)中，酒輕飲濃度達(dá)到31.3 μL/mL時(shí)，斑馬魚(yú)出現(xiàn)異常，較模型組狀態(tài)差，高于250 μL/mL濃度后出現(xiàn)死亡，死亡率直線上升；在ALT活力降低作用實(shí)驗(yàn)中，酒輕飲濃度達(dá)到15.6 μL/mL時(shí)，并未出現(xiàn)明顯異常，高于此濃度后，死亡率直線上升。可知本實(shí)驗(yàn)條件下，胃腸道黏膜保護(hù)作用評(píng)價(jià)MTC為62.5 μL/mL；解酒作用評(píng)價(jià)MTC為15.6 μL/mL；ALT活力降低作用評(píng)價(jià)MTC為15.6 μL/mL。

表2 酒輕飲濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.2.2 作用結(jié)果

根據(jù)MTC設(shè)計(jì)濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1，陽(yáng)性對(duì)照組、31.3 μL/mL及62.5 μL/mL組別均可顯著降低斑馬魚(yú)腸腔面積，可提升腸胃黏膜保護(hù)作用。由表3可知，與模型組相較而言，陽(yáng)性對(duì)照及劑量組均可提升總運(yùn)動(dòng)距離，興奮期明顯延長(zhǎng)，解酒效果明顯；降低ALT活力，對(duì)酒精引起的臟器保護(hù)作用明顯。

表3 酒輕飲作用（未見(jiàn)異常組）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 酒輕飲處理后斑馬魚(yú)腸腔面積典型圖

5 結(jié)論與討論

酒精中毒是指乙醇飲用過(guò)量而導(dǎo)致的機(jī)體損傷，尤其作用于神經(jīng)中樞和肝臟[11]。急性酒精中毒過(guò)程常分為3個(gè)階段，即興奮期、共濟(jì)失調(diào)期、昏睡期[11]。興奮期采用斑馬魚(yú)模型，MTC檢測(cè)可清楚分辨興奮期，準(zhǔn)確確定劑量，對(duì)興奮期斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離和ALT活性進(jìn)行檢測(cè)。昏睡期采用小鼠模型，進(jìn)行肝指數(shù)、ALT、AST和翻正反射消失實(shí)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)是觀察處于異常體位的動(dòng)物是否能恢復(fù)正常體位來(lái)確定動(dòng)物的反射狀況，是判斷動(dòng)物是否醉酒的經(jīng)典方法[11]。肝組織作為解酒的重要器官。酒精引發(fā)肝脂肪變性，導(dǎo)致肝指數(shù)上升，肝組織中的ALT、AST酶流入血液，檢測(cè)此3項(xiàng)可反應(yīng)機(jī)體對(duì)酒精的處理情況及肝保護(hù)情況。乙醇刺激可導(dǎo)致胃腸黏膜損傷，長(zhǎng)期過(guò)量刺激可導(dǎo)致急慢性胃腸炎，實(shí)驗(yàn)采用斑馬魚(yú)胃腸黏膜損傷模型，研究對(duì)于胃腸黏膜的保護(hù) 作用。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在興奮期，劑量組與模型組比較，斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離明顯降低，斑馬魚(yú)進(jìn)入興奮期推遲，機(jī)體解酒能力提升；體內(nèi)ALT活力檢測(cè)結(jié)果7.81 μL/mL 及15.6 μL/mL劑量組明顯下降，斑馬魚(yú)肝損傷程度下降，ALT活力降低作用明顯。昏睡期，中高劑量組，翻正反射恢復(fù)時(shí)間存在顯著性縮短，體內(nèi)轉(zhuǎn)化乙醇能力增強(qiáng)。ALT、AST活力無(wú)顯著性。肝指數(shù)中劑量組明顯下降，肝臟器官病變腫大情況減弱。胃腸保護(hù)作用研究中，斑馬魚(yú)腸腔面積變化明顯，酒輕飲對(duì)于TNBS引起的胃腸黏膜損傷有很好的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)在不同實(shí)驗(yàn)方向選用動(dòng)物品種和模型不同，期望從多角度研究酒輕飲的作用。但結(jié)果不盡人意，未達(dá)到預(yù)期效果，顯著性不同。酒輕飲對(duì)于小鼠模型檢測(cè)效果不佳，生化檢測(cè)指標(biāo)無(wú)顯著性，行為檢測(cè)結(jié)果存在顯著性，但劑量關(guān)聯(lián)不明確，由數(shù)據(jù)看，可能存在劑量設(shè)計(jì)不合理問(wèn)題，待后續(xù)繼續(xù)研究；對(duì)3種模型斑馬魚(yú)的保護(hù)作用顯著，與斑馬魚(yú)同尾產(chǎn)出，個(gè)體差異小結(jié)果效果顯著相符，但作用效果與劑量關(guān)系關(guān)聯(lián)不明確[13]。本實(shí)驗(yàn)方案雖結(jié)合小鼠及斑馬魚(yú)動(dòng)物模型，但小鼠及斑馬魚(yú)無(wú)法相互驗(yàn)證，斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)在酒精中毒興奮期進(jìn)行檢測(cè)，而小鼠實(shí)驗(yàn)翻正反射在昏睡期進(jìn)行。由斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)可知，酒輕飲可以起到保護(hù)胃腸黏膜，解酒護(hù)肝的功效，但在毒理和量效關(guān)系上需進(jìn)一步進(jìn)行研究。