三聚氰胺前處理優化的檢測方法

錢成林，吳 思，鄭旭濤，董成虎，陳權翠*

（1.新希望乳業股份有限公司食品安全監管部，四川成都 610000； 2.華測檢測認證集團股份有限公司（云南華測檢測認證有限公司），云南昆明 650000）

三聚氰胺（C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，被用作化工原料。它是白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水（3.1 g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油及吡啶等，不溶于丙酮、醚類，對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。臨床研究發現，三聚氰胺可能會在人體泌尿系統如膀胱和腎臟形成泥沙樣結晶或 結石[1]。

中國國家食品質量監督檢測中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺屬于化工原料，不允許添加到食品中，故暫未設定像農藥般的殘留標準限制。除了人為添加外，三聚氰胺類物質還可能從環境、食品包裝材料等途徑進入到食品，且其含量極低。由于動物源食品基質背景復雜、所需前處理過程煩瑣費時，因此開發復雜食品基質中痕量三聚氰胺類物質快速、高靈敏分析檢測方法對保障我國食品安全具有重要的意義[2]。2008年10月8日，原衛生部、工業和信息化部、農業部、國家工商行政管理總局和國家質量監督檢驗檢疫總局聯合發布公告，制定三聚氰胺在乳與乳制品中的臨時管理值。

嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg， 高于1 mg/kg的產品一律不得銷售。液態奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為 2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的產品一律不得銷售。目前使用的檢測方法有GB/T 22388—2008原料乳及乳制品中三聚氰胺檢測第一法高效液相色譜法[3]和 GB/T 22400—2008原料乳中三聚氰胺檢測方法[4]，按照檢測方法檢測結果有所偏低，方法檢出限為2.0 mg/kg，加標濃度為2～10 mg/kg，回收率在80%～110%，不能滿足《合格評定 化學分析方法確認和認證指南》（GB/T 27417—2017）關于加標回收率的要求，在目前的方法上進行改進，檢測結果更加準確可靠。加標回收率都在90%～110%，滿足要求[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶樣品，工廠奶罐檢測合格牛奶；乙腈（色譜純，生產批號：148405，德國默克）；檸檬酸（分析純，生產批號：20140201，重慶川東化工有限公司）；辛烷磺酸鈉（分析純，生產批號：20160602，國藥集團化學試劑有限公司）；三氯乙酸（分析純，生產批號：20130124，廣東光華科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，生產批號：1847607，德國默克）；超純水，實驗室自制。

離子對緩沖試劑：使用ME204E電子天平準確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉，加入約980 mL 超純水，調節pH值至3.0，用水定容至1000 mL。使用0.45 μm水相濾膜過濾后進行使用。

1.2 儀器與設備

安捷倫高效液相色譜儀1260（美國Aligent，紫外檢測器VWD，檢測波長240 nm，檢測溫度40 ℃）；ME204E電子天平，精確度0.0001 g，梅特勒托利多。

1.3 實驗方法

1.3.1 操作步驟

使用1000 mg/L的標準品進行加標至1.25 mg/L、 2.50 mg/L、10.00 mg/L。分別18次準確稱取（2.000± 0.010）g制備好的加標樣品至50 mL離心管中，準確移取18 mL濃度為2%的三氯乙酸溶液和5 mL乙腈溶液至每只離心管中，渦旋混勻1 min，超聲提取10 min，振蕩提10 min，6000 r/min離心10 min。 用濾紙進行過濾后作為凈化液，過濾溶液時間從 30 min，縮短到5 min左右。再用3 mL甲醇和5 mL水先后過活化好的陽離子交換柱，將凈化液5 mL加5 mL水混勻后過柱，繼續用3 mL水和3 mL甲醇先后過柱，加入6 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，將洗脫液置于50 ℃氮吹至干，取出比色管加入1 mL流動相溶液用0.45 μm濾膜過濾到進樣瓶中。沒有加標的樣品依據上述方法進行檢測。

1.3.2 進樣條件

色譜柱C18（150 mm×4.6 mm×5 μm）；波長：紫外240 nm；柱溫：40 ℃；進樣體積：20 μL；流速：1 mL/min；洗脫方式：等度洗脫。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

依據標準曲線濃度及峰面積結果，繪制標準曲線，線性關系y=ax+b，其中a=82.355，b=-3.1957， 線性相關系數R2=0.9997，可以滿足≥0.999以上的要求，具體見圖1。

圖1 標準曲線線性關系

2.2 加標回收率

依據回收率標準要求（表1），分別加標至 1.25 mg/L、2.50 mg/L、10.00 mg/L，并進行平行測定6次，加標回收率在95.1%～108.4%，其中加標至1.25 mg/L的樣品加標回收率在98.5%～108.4%，加標濃度至2.50 mg/L的樣品加標回收率為98.8%～ 100.9%，加標濃度至10.00 mg/L的樣品加標回收率在95.1%～98.5%，都能滿足加標回收率在90%～110%的要求。加標回收率見表2。

表1 加標回收率標準要求

表2 加標回收率結果表（n=6）

2.3 精密度

計算1.25 mg/L、2.50 mg/L、10.00 mg/L的加標檢測結果，RSD值都低于5%，滿足RSD的要求，見 表3。

表3 樣品精密度

2.4 方法檢出限和定量限

按照標準方法進行加標實驗，查看安捷倫1260高效液相色譜儀18次檢測結果的信噪比，3倍的信噪比作為方法檢出限，10倍的信噪比作為方法定量限。由于檢測18個檢測結果計算的方法檢出限和定量限都不一致，采用18次計算結果的平均值作為方法檢出限和定量限。方法檢出限為0.08 mg/L，方法定量限為0.28 mg/L，見表4。

表4 方法檢出限與定量限（單位：mg/L）

2.5 優化方法與國標方法對比

優化方法與國標方法對比結果見表5，優化方法檢出限更低，定容時間短，加標回收率符合要求。

表5 優化方法與國標方法對比情況

3 結論

結果表明，更改前處理方法后，過濾定容時間從原來30 min縮短至5 min，定容時間縮短至原來的1/6；加標回收率有明顯改善，從80%～110%上升至95.1%～108.4%，改善比較明顯，檢測準確性提高；精密度實驗方面，加標樣品檢測偏差RSD值在5%以內；方法檢出限為0.08 mg/kg，方法定量限為 0.28 mg/kg，與原有標準的定量限2.0 mg/kg相比降低顯著，低濃度樣品更加容易檢出。所以更改定容方式后檢測結果更加高效、準確、可靠。