氟啶蟲酰胺對3種水生生物的急性毒性

羅澤偉，孔玄慶，雷 琪，朱雄梅，金晨鐘*

(1.湖南人文科技學院農田雜草防控技術與應用協同創新中心，湖南婁底 417000;2.湖南化工研究院國家農藥創制工程研究中心/湖南省農用化學品重點實驗室,湖南長沙 410014；3. 湖南化研院檢測技術有限公司，湖南長沙 410014)

氟啶蟲酰胺是一種吡啶酰胺類昆蟲生長調節劑類殺蟲劑，能夠高效防治作物上的刺吸式口器害蟲，氟啶蟲酰胺對蚜蟲類防治最為高效。氟啶蟲酰胺因其特殊的作用機理，與其他殺蟲劑沒有交互抗性，良好的防治效果，在我國銷量和使用量日益劇增。

目前關于氟啶蟲酰胺的研究主要集中在蚜蟲的防效，高德良等在施用10%氟啶蟲酰胺水分散粒劑14 d后，20、40、60 mg/L處理組的防效分別為94.2%、98.4%、99.2%。趙娟娟等施用30%氟啶蟲酰胺和20%啶蟲脒復配后對蘋果樹繡線菊蚜的防治效果在藥后第3天和第10天高達99.7%、98.36%。但關于氟啶蟲酰胺對環境生物的影響較少。據報道，氟啶蟲酰胺對蜜蜂的毒性為低毒，對蜜蜂經口和接觸毒性的48 h-LD值均>100 μg/蜂。閆浩浩等比較了不同劑型氟啶蟲酰胺對家蠶的急性毒性，98%氟啶蟲酰胺原藥、10%氟啶蟲酰胺水分散粒劑、10%氟啶蟲酰胺懸浮劑和 8%氟啶蟲酰胺可分散油懸浮劑對家蠶為低毒，氟啶蟲酰胺與呋蟲胺和氟啶蟲酰胺與聯苯菊酯的復配制劑分別為高毒和劇毒。目前關于氟啶蟲酰胺對水生生物的毒性研究鮮見報道，故開展氟啶蟲酰胺對水生生物毒性的研究，評價氟啶蟲酰胺對水生生物的危害具有重大意義。

筆者以氟啶蟲酰胺為試驗藥劑，參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》和OECD化學物質對水生生物毒性試驗方法，研究氟啶蟲酰胺對斜生柵藻、大型溞和斑馬魚的急性毒性，旨在為氟啶蟲酰胺的水生生態環境風險評估提供基礎數據。

1 材料與方法

斜生柵藻()，引種于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。在溫度(23±1) ℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的培養條件下使用水生4號培養基對斜生柵藻轉接3次后，選擇培養72 h的斜生柵藻用于試驗。

大型溞()，引種于中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所。在(22±1) ℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的培養條件下培養3代以上，選擇出生時間6～24 h、活潑健康的幼溞進行試驗。

斑馬魚()，購于長沙市徐記水族館。在(24±1)℃、光周期16 h∶8 h(L∶D)的培養條件下培養8 d，馴養期間每天喂食2次。試驗前24 h停止喂食，試驗期間不喂食，選擇活潑健康的斑馬魚進行試驗。

主要試劑：氟啶蟲酰胺，青島東生藥業有限公司提供；甲醇(色譜純)、丙酮(分析純)，購于國藥集團化學試劑有限公司；水生4號培養基和ISO標準稀釋水，實驗室配制，現配現用。

主要儀器：LC-20A型高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器和化學工作站(日本島津公司)、AUY220型電子天平 (日本島津公司)、燒杯、容量瓶等。

試驗條件與斜生柵藻、大型溞和斑馬魚的培養條件基本相同，光照/黑暗時間比為16 h∶8 h(L∶D)，培養和試驗環境溫度控制在22～24 ℃。

氟啶蟲酰胺對斜生柵藻的急性毒性試驗。參照《化學農藥環境安全評價試驗準則 第14部分：藻類生長抑制試驗》，根據預試驗結果，以水生4號培養液為稀釋液設置氟啶蟲酰胺濃度依次為39.00、50.70、65.91、85.68、111.39 mg/L，接種藻液后，藻細胞初始濃度為1.00×10個/mL，同時每個處理設置3個重復并設置空白對照。試驗開始后，采用血球計數板計數藻細胞濃度，在第0、24、48、72 h記錄各處理組藻細胞生長抑制情況。

氟啶蟲酰胺對大型溞的急性毒性試驗。參照《化學農藥環境安全評價試驗準則 第13部分：溞類急性活動抑制試驗》，根據預試驗結果，以ISO標準稀釋水設置氟啶蟲酰胺濃度依次為19.29、23.15、27.78、33.33、40.00 mg/L，每個處理重復3次，并設置空白對照組，每個處理放置10只幼溞。試驗開始后，在第24、48 h觀察并記錄大型溞的生長情況。

氟啶蟲酰胺對斑馬魚的急性毒性試驗。參照《化學農藥環境安全評價試驗準則 第12部分：魚類急性毒性試驗》，根據預試驗結果，以去氯處理24 h以上曝氣自來水設置氟啶蟲酰胺濃度依次為50.0、60.0、72.0、86.4、103.7 mg/L，同時設置空白對照，不設重復，每次缸內放置10條健康活潑的斑馬魚。試驗開始后，在第24、48、72和96 h觀察并記錄斑馬魚生長情況，并及時清理死魚。

為獲得更準確可靠的試驗結果，參照馬明等方法并稍作改動。

UPLC檢測條件：高效液相色譜儀(島津-LC-20AT型，帶紫外檢測器和 LC solution 化學工作站)。色譜柱，C柱，250 mm×4.6 mm (i.d)不銹鋼柱，5 μm；流動相，乙腈-水 (50/50,)；流速，1.0 mL/min；檢測波長，265 nm；柱溫，40 ℃；進樣量，20 μL；保留時間，約3.9 min。

建立標準曲線：準確稱取0.050 5 g氟啶蟲酰胺標準品置于小燒杯，加少量乙腈溶解，轉至100 mL容量瓶中，用乙腈沖洗燒杯多次并轉至容量瓶中，再用乙腈定容至刻度，配制成500 mg/L標準溶液。然后乙腈稀釋，配制成氟啶蟲酰胺10、20、40、60、80、120 mg/L濃度的系列標準溶液，分別取上述系列標準溶液按照上述UPLC檢測條件進行檢測，每個濃度重復3次。

樣品前處理：用玻璃棒攪均勻后靜置3 min，取試驗水樣過0.45 μm濾膜，上機檢測。斜生柵藻取樣時間0、72 h，大型溞取樣時間0、48 h，斑馬魚取樣時間0、48、96 h。

添加回收：分別取濃度為500 mg/L的標準工作溶液6和22 mL，用試驗用水分別定容至100 mL，使水體添加濃度分別為30和110 mg/L 2個添加水平，同時設不加藥的空白對照。試驗水樣按照上述前處理方法進行處理，按照上述UPLC檢測條件后檢測，每個濃度重復5次，計算添加回收率。

采用SPSS 16.0進行數據處理與分析，以初始濃度值計算氟啶蟲酰胺對斜生柵藻、大型溞的半數抑制濃度(EC)和斑馬魚的半致死濃度(LC)。

2 結果與分析

以濃度為橫坐標()，峰面積為縱坐標()，進行線性回歸分析，得到標準曲線方程為=19 02756-3 48569(=0999 9)。斜生柵藻試驗的添加回收率在93.05%～102.63%，相對標準偏差為2.76%和0.58%。大型溞試驗的添加回收率在93.85%～100.48%，相對標準偏差為0.98%和2.81%。斑馬魚試驗的添加回收率在89.87%～100.75%，相對標準偏差為1.55%和1.74%。試驗周期內各組氟啶蟲酰胺的質量濃度測定結果見表1。由表1可知，試驗過程中濃度變化率未超過20%，符合該試驗各驗證內容的質量控制要求。

表1 氟啶蟲酰胺實測濃度Table 1 Measured mass concentration of flonicamid

試驗期間，氟啶蟲酰胺處理濃度越高，藻細胞數量越少。染毒24 h后，低濃度藻細胞大小正常，高濃度藻細胞偏小。染毒48 h后，對照組和低濃度處理組藻液呈綠色和黃綠色，85.68、111.39 mg/L處理組藻液無色，表明此濃度處理下藻細胞生長受到抑制。染毒72 h后，39.00、50.70、65.91、85.68、111.39 mg/L處理組藻細胞濃度分別增長88.83、71.17、48.17、25.17、12.67倍，對照組細胞濃度增長104.83倍。

采用初始濃度值計算氟啶蟲酰胺對斜生柵藻進行生長抑制毒性的數據分析，以濃度對數為橫坐標，抑制率為縱坐標進行擬合，計算其生物量半效應濃度EC，結果見表2。由表2可知，氟啶蟲酰胺對斜生柵藻的48 h-EC為77.28 mg/L，72 h-EC為60.16 mg/L。由于24 h時斜生柵藻的最高生長抑制率小于50%，因此不進行數據分析。

表2 氟啶蟲酰胺對斜生柵藻生長抑制試驗結果Table 2 Results of the growth inhibition test of fludilanamide on Scenedesmus obliquus

試驗期間，氟啶蟲酰胺處理濃度越高，大型溞活動越遲緩。染毒24 h后，低濃度受抑制溞數較少，高濃度受抑制溞數較多，受抑制的大型溞體色發白，不再透明；各處理組未受抑制溞均游動緩慢。染毒48 h后，19.29、23.15、27.78 mg/L處理組受抑制總溞數為7、13、19只，未受抑制溞游動緩慢，部分溞身體發白。高濃度處理組(33.33和40.00 mg/L)中溞幾乎受到了抑制，受抑制溞均身體發白，身體不再透明，輕搖燒杯，觀察不到溞游動，未受抑制溞浮于水面，輕搖燒杯，溞緩慢游動。

采用初始濃度值計算氟啶蟲酰胺對大型溞進行急性活動抑制毒性的數據分析，以濃度對數為橫坐標，抑制率為縱坐標進行擬合，計算各指標的EC，結果見表3。從表3可以看出，氟啶蟲酰胺對大型溞的24 h-EC為30.04 mg/L，48 h-EC為25.27 mg/L。

表3 氟啶蟲酰胺對大型溞急性活動抑制試驗結果Table 3 Results of acute activity inhibition test of fludinamide on Daphnia magna

試驗期間，氟啶蟲酰胺處理濃度越高，斑馬魚中毒癥狀越明顯。染毒24 h后，低濃度處理組無明顯中毒癥狀，高濃度處理組有部分魚出現身體失衡和死亡的情況。染毒48 h后，低濃度處理組中斑馬魚情況良好，72.0 mg/L處理組魚體出現呼吸急促、魚鰓張合頻繁的情況，高濃度處理組死亡魚數增加。染毒72 h后，所有處理組均出現魚死亡的情況，低濃度處理組(50.0和60.0 mg/L)未死亡魚無明顯中毒癥狀，72.0 mg/L處理組中未死亡魚游動較慢，86.4和103.7 mg/L中未死亡魚呼吸較急促，鰓張合頻繁，中毒癥狀明顯。染毒后約96 h，各處理組的魚不再繼續死亡。

采用初始濃度值計算氟啶蟲酰胺對斑馬魚進行急性毒性的數據分析，以濃度對數為橫坐標，抑制率為縱坐標進行擬合，計算各指標的LC，結果見表4。從表4可以看出，氟啶蟲酰胺對斑馬魚的48 h-LC為91.07 mg/L，72 h-LC為73.91 mg/L，96 h-LC為73.91 mg/L。由于24 h時斑馬魚的最高死亡率小于50%，因此不進行數據分析。

表4 氟啶蟲酰胺對斑馬魚急性毒性試驗結果Table 4 Results of acute toxicity test of fludinamide to Brachydonio rerio

3 結論與討論

氟啶蟲酰胺作為一種新型的吡啶酰胺類昆蟲生長調節劑，在我國殺蟲劑市場占有相當重要的地位，隨著氟啶蟲酰胺銷量的持續走高，氟啶蟲酰胺對環境生物的影響受到重視。該研究中氟啶蟲酰胺對斜生柵藻的48 h-EC為77.28 mg/L，72 h-EC為60.16 mg/L，對大型溞的24 h-EC為30.04 mg/L，48 h-EC為25.27 mg/L，對斑馬魚的48 h-LC為91.07 mg/L，72 h-LC為73.91 mg/L，96 h-LC為73.91 mg/L。參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》中農藥對斜生柵藻、大型溞和斑馬魚的毒性等級劃分可確定氟啶蟲酰胺對斜生柵藻、大型溞和斑馬魚的毒性等級均為低毒。

林濤等發現氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺3種殺蟲劑對斜生柵藻為低毒，對大型溞為劇毒，對斑馬魚為低毒，其原因可能是藻類和斑馬魚缺少某種魚尼丁受體或者與魚尼丁受體的氨基酸序列相似度低，而大型溞的魚尼丁受體的氨基酸序列相似度高。該研究中，氟啶蟲酰胺對斜生柵藻、大型溞和斑馬魚的急性毒性都很低，其原因可能是氟啶蟲酰胺的作用機理獨特，對刺吸式口器害蟲有很好的拒食活性，對乙酰膽堿酯酶和煙堿乙酰膽堿受體沒有作用，使得氟啶蟲酰胺對斜生柵藻、大型溞和斑馬魚的毒性較低。

束兆林等研究表明氟啶蟲酰胺在白背飛虱低齡若蟲高峰期用藥，對飛虱有很好的防治效果，且對田間天敵蜘蛛安全性較高。氟啶蟲酰胺對人、畜、環境都有很高的安全性，但單一的毒性數據并不能夠準確全面反映氟啶蟲酰胺對水生生物的風險情況，可根據《環境風險評估指南》對氟啶蟲酰胺進行全面的水生生態風險評估。該研究為氟啶蟲酰胺進一步環境風險評估提供了生態毒理數據支撐。