野生彩茶“藍寶石”抗褐化及叢生芽誘導研究

楊玉珍

(南陽農業職業學院植物組織培養中心，河南南陽 473000)

野生彩茶“藍寶石”(cv. “lanbaoshi”),屬山茶科山茶屬灌木小葉種變種，發現于大別山腹地桐柏山天云峰北斗湖畔，牙尖初期呈紫紅色，散開后逐漸變藍色至深藍色。有反射藍光，故命名為“藍寶石”。送檢結果表明，其花青素含量約6.4 mg/g、氨基酸4.4%、茶多酚22.8%、茶紅素8.65%、茶褐素8.07%、茶黃素0.61%、咖啡堿3.8%。制作綠茶湯色黃綠相間，制作紅茶形如火焰，棕紅鮮艷，香味醇厚耐泡。彩茶母樹稀缺，若采用傳統的扦插繁育，由于基數少，成苗需3年左右，遠遠不能滿足市場對該珍貴彩茶種苗的需求，因此急需快速大量繁育。目前，茶樹組織培養技術雖有成功先例，但彩茶尚缺少相關組織培養研究。有關資料顯示，茶樹組織培養中因多酚含量高，且自身攜帶較多內生菌，導致外植體易污染、褐化嚴重、難以分化和生長緩慢等，其中最關鍵的問題是褐化，尤其是彩茶，檢測結果顯示其茶黃素、茶紅素、茶褐素、茶多酚、兒茶素、咖啡堿含量均較高，外植體更易褐化死亡。外植體能否克服褐化成活下來，是決定后期能否繼續開展組培與快速繁育的關鍵，也是彩茶良種無性繁殖技術的瓶頸問題。因此，筆者以彩茶“藍寶石”新生枝條為外植體進行組織培養，探尋建立快速繁育的關鍵技術，以期為彩茶產業化種植提供技術支撐。

1 材料與方法

供試材料為桐柏山野生彩茶“藍寶石”母株上采集的新生枝條。試驗地點在南陽農業職業學院植物組織培養中心。

將健壯彩茶枝條從山上帶回后沖洗干凈，基部浸泡在潔凈水中2 d，置于陰涼低溫處，每天換水，接種當天把枝條取出，將彩茶“藍寶石”基部成熟葉片摘下，用洗滌劑溶液浸泡5 min左右，用軟毛刷仔細清洗后，剪成1.5 cm左右帶腋芽的莖段。將帶腋芽的莖段分別用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡2 h，然后用800倍甲基托布津溶液浸泡2 h，然后用自來水沖洗0.5 h。

不同滅菌時間處理。將預處理后的莖段置于超凈工作臺上，先用75%乙醇消毒20 s，再置于0.1% HgCl溶液中分別處理10、12、15、20、25 min，再用無菌水沖洗5遍；根據文獻資料和預備試驗結果，用MS作為基本培養基，5個處理時間分別接種20瓶，每瓶接種1個莖段，10 d后觀察統計污染率、褐化率。

添加不同抗褐化成分對比。MS分別加入10 mg/L V溶液、1 g/L AC、100 mg/L PVP、10 mg/L V+1 g/L AC及對照(CK)共5個處理，每處理接種20瓶，每瓶接種1個莖段，10 d后觀察統計污染率、褐化率。

不定芽誘導培養。將獲得的無菌莖段接種到培養基上，選取6-BA、NAA、IBA 3種激素進行不同濃度的組合配比試驗，MS培養基為基本培養基，探討其對彩茶“藍寶石”腋芽萌發的影響。每處理分別接種20瓶，每瓶接種1個外植體莖段，定期觀察無菌芽的生長情況，30 d后統計腋芽誘導情況。

叢生芽增殖培養。根據文獻資料和以上的試驗結果，選擇 MS+1.0 mg/L 6-BA為基礎培養基，設置NAA濃度為0.5～1.0 mg/L，6-BA濃度為1.0～3.0 mg/L，IBA濃度為1.0～2.0 mg/L，GA濃度為0.5～1.0 mg/L，將誘導培養獲得的不定芽分切后，接種到增殖培養基上，每處理接種20瓶，每瓶接種1個芽叢，35 d后觀察芽的生長情況。

培養條件。以MS培養基為基本培養基，3%蔗糖，0.5%瓊脂，pH 為5.6～5.8。光照時間12 h/d，強度2 500 lx，溫度控制在22～24 ℃。

2 結果與分析

由于茶樹植株中酚類物質含量高，外植體切割時傷口的多酚類物質遇到氧氣產生褐色醛類物質，易擴散到培養基使外植體和培養基褐變，以致外植體死亡。農艷豐等研究發現，在培養基中添加1.0 g/L V和1.0 g/L AC，能將外植體的褐化率降至41%。根據相關文獻、預備試驗和以往經驗，在培養基中加入抗氧化劑及吸附劑也能減輕外植體在組織培養過程中褐變，如在培養基中加入抗氧化劑V、PVP、活性炭，可以吸附培養基中的醌和酚等有害物質，減輕褐變。因此，筆者首先將外植體基部浸泡在潔凈水中1 d，置于陰涼低溫處，每天換水進行統一預處理，以有效隔斷氧化，溶解、稀釋傷口產生的酚類物質，減少酚類物質在培養基中的富集，有效減輕褐變。茶樹組織培養分為一般性污染和內源性污染。內源性污染是由植株自身攜帶的內生菌引起的，一般的表面滅菌難以達到應有的效果，建立無菌體系時，極易發生內生菌污染。試驗用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡2 h，使高錳酸鉀對浸泡的莖段切口產生氧化，從而預先去除部分醌類物質，以抑制褐化現象；然后用800倍甲基托布津溶液進行浸泡2 d,以減少表面及內生菌引起的污染，一系列預處理可有效降低因外植體滅菌處理時間過長導致的褐化死亡和污染。

將外植體采用 0.1% HgCl按不同時間滅菌，接種后20 d調查記錄，比較不同滅菌方式處理效果。由表1可知，對外植體采用不同滅菌時間處理，滅菌時間過長，對材料造成傷害，導致材料褐化枯死。處理12 min時間過短，滅菌不徹底，材料污染率高，達90%；處理24 min污染率低(20%)，但大部分莖段褪去綠色褐化死亡，枯死率達70%,說明滅菌劑在滅菌的同時傷害了莖段；滅菌處理20 min莖段污染率為35%，存活率達到35%，較為理想。

表1 不同滅菌時間對莖段存活率的影響Table 1 Effect of different sterilization time on stem survival rate

在預處理的基礎上，批量采用75%乙醇進行表面消毒20 s，0.1% HgCl滅菌處理外植體20 min，接種10 d后，將存活莖段轉接到不同培養基中進行進一步抗褐化處理。由表2可知，不同處理對抗褐化均有一定的效果，4 個處理與 CK 相比，褐化率均有所降低，均控制在 45% 及以下。培養基中以添加10 mg/L V+1 g AC效果最好，存活率達75%。這與農艷豐等的研究結果一致。該試驗表明，彩茶培養基中同時添加1 g/L AC和10 mg/L V能有效防止褐化。

表2 不同添加物對外植體的抗褐化效果Table 2 Anti-browning effect of different additives on explants

莖段在啟動培養基上15 d側芽開始萌動，30 d后將啟動培養的側芽切下，接種于添加不同激素的不定芽誘導培養基上，30 d后統計不同培養基中的不定芽生長情況。由表3可知， 6-BA濃度在0.5～1.0 mg/L 時，叢生芽的長勢較好，但2.0 mg/L 6-BA 時，叢生芽的分化數量逐漸減少。當6-BA 濃度為2.0～3.0 mg/L時，外植體的基部誘導出了愈傷組織，腋芽生長緩慢，既不長高也不分化叢生芽。但隨著NAA濃度升高，叢生芽的長勢變差，芽誘導的個數逐漸減少。當NAA為0.5 mg/L時，叢生芽呈綠色；而當 NAA為1.0 mg/L 時，叢生芽少，比較細弱，向上生長較快。比較配方E、F數據可知，1.0 mg/L 6-BA的培養基添加較高濃度的NAA和IBA時有利于外植體腋芽誘導叢生芽，即1.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L NAA時，添加IBA對叢生芽的生長有明顯的促進作用，此時腋芽誘導叢生芽的效果較好，萌芽數量多，長勢最好。不同激素配比處理的不定芽誘導情況見圖1。

表3 不同激素配比處理誘導不定芽效果Table 3 Effects of different hormone ratios on the induction of adventitious buds

圖1 不同激素配比不定芽誘導情況Fig.1 Adventitious bud induction with different hormone ratios

誘導出不定芽后，需要繼續誘導大量叢生芽，試驗將誘導出的不定芽轉接到不同濃度組合增殖培養基中，篩選最佳增殖培養基，接種后30 d調查叢生芽增殖生長情況，結果見表4。由表4可知，增殖階段與腋芽誘導不定芽階段相比，6-BA濃度從1.0 mg/L增加到2.0 mg/L對不定芽的誘導增殖作用更明顯，不添加IBA改為添加GA后對不定芽誘導沒有明顯的促進作用，說明GA對彩茶“藍寶石”叢生芽誘導生長作用不明顯，但過高濃度的6-BA反而導致叢生芽低矮，緊實，生長緩慢。從圖2可以看出，處理e的生長情況最好，當6-BA濃度為2.0 mg/L，NAA為1.0 mg/L，IBA 2.0 mg/L時有利于不定芽的分化，芽增殖倍數較高，達7，且苗健壯，生長快。叢生芽在誘導培養基中生長25 d左右，將叢生芽切分后轉入新鮮的增殖培養基中培養，每35 d繼代1次。

3 結論

該試驗在參考前人有關茶樹和其他富含內生菌的外植體材料組織培養方案研究的基礎上，研究彩茶“藍寶石”的無菌體系建立及抗褐化方法，誘導出大量叢生芽，為快速繁育稀缺新種質茶樹優良種苗奠定基礎，同時為茶樹良種繁育和資源保存提供技術支持。該試驗外植體滅菌預處理為枝條清水浸泡，再用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡2 h，使高錳酸鉀對浸泡中的莖段切口產生氧化，從而預先去除部分醌類物質，以降低酚類物質氧化產生的褐化現象；然后用800倍甲基托布津溶液浸泡2 d以減少表面及內生菌引起的污染，一系列預處理對降低外植體滅菌處理時間過長導致的褐化死亡和污染打下基礎。使用濃度0.1% HgCl溶液進行滅菌，以20 min為較好。莖段腋芽誘導不定芽以較低濃度的NAA配合6-BA可誘導叢生芽的生長，但增殖及生長速度不高，前期高濃度6-BA還會導致褐化明顯，分析原因可能是由于6-BA刺激多酚氧化酶的活性，在外植體脫分化階段，分生能力強的細胞大量增殖，酚類的氧化會受到激活，從而誘導出大量愈傷組織生成。因此，野生彩茶腋芽誘導不定芽最佳培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L；但在叢生芽增殖階段，已經完成了脫分化，褐變已被抑制，增加激素用量不再引起褐變，誘導出無菌短枝和叢生芽經分切后再用較高濃度激素的培養基，彩茶叢生芽的增殖效果較好，叢生芽的數量多，添加適量IBA后對無菌短枝的伸長效果明顯，長勢最好，因此篩選叢生芽增殖階段培養基以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 2.0 mg/L為佳。后續需要繼續探討其他激素對生根的影響，篩選最適宜配比。試驗還發現試管苗幼嫩叢生芽階段彩茶葉色表現不明顯，大苗階段會呈現品種特性，生根試驗和移栽煉苗還需要進一步探索和研究。

表4 不同激素配比對不定芽增殖的影響Table 4 Effects of different hormone ratio on inducing adventitious bud proliferation

圖2 不同激素配比不定芽增殖情況Fig.2 Proliferation of adventitious buds with different hormone ratios