氣相色譜法測定人血白蛋白辛酸鈉含量的方法優化

王文杰，吳翠，宋大章，吳浩蔚

（廣東衛倫生物制藥有限公司，廣東汕頭 515071）

人血白蛋白在臨床上主要用于失血創傷、燒傷引起的休克以及腦水腫和損傷引起的顱壓升高等的治療。人血白蛋白制品中加入適量的辛酸鈉，可以保證制品的穩定性，但是辛酸鈉有很多生物學作用，如引起低血糖癥，對各類動物有麻醉作用，增加氧的消耗，降低肝臟對長鏈脂肪酸的清除作用，血管舒張作用以及降低肌肉收縮力等作用[1]。《中華人民共和國藥典》三部（2020年版）[2]中規定，人血白蛋白辛酸鈉含量為“每1 g蛋白質中應為0.140～0.180 mmol”。筆者長期使用該方法發現，該方法重復性不理想，容易出現實驗室偏差。經分析，出現偏差的原因可能是4 mL三氯甲烷揮干后，再加100 μL三氯甲烷溶解殘渣不完全，進樣溶液濃度不能代表供試品溶液濃度，因此筆者擬刪去藥典中辛酸鈉含量測定方法中的“將三氯甲烷揮發至干，另加三氯甲烷100μL溶解殘渣”，即不揮發至干直接進樣，開展人血白蛋白辛酸鈉含量測定（氣相色譜法），對優化前、后的方法進行對比研究，進一步提升檢驗的效率和水平。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

GC-2010Plus氣相色譜儀（配FID檢測器），日本島津公司；BP21色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 um），澳大利亞SGE公司；CPA225D電子微量天平，賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

辛酸標準品（批號6827100），純度99.5%，美國CHEM-SERVICE公司；庚酸標準品（批號6415900），純度99.5%，美國CHEM-SERVICE公司；高氯酸（批號20150701），色譜純，天津政成化學制品有限公司；三氯甲烷（批號20160106-2），分析純，廣州化學試劑廠；人血白蛋白供試品（10 g/瓶，批號20180712、20180813、20180814、20180815、20180916、20181017），廣東衛倫生物制藥有限公司；人血白蛋白質控品（批號20170421-3），廣東衛倫生物制藥有限公司；每1 g蛋白質中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標回收率溶液，廣東衛倫生物制藥有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

用酸改性聚乙二醇毛細管柱（20 m），柱溫160 ℃，火焰離子化檢測器，檢測器溫度230 ℃，氣化室溫度230 ℃，載氣(氮氣)流速為35 mL/min。

辛酸峰與庚酸峰的分離度應大于1.5，辛酸峰的拖尾因子應為0.95～1.20，辛酸對照品溶液連續進樣5次，所得辛酸峰與庚酸峰面積之比的相對標準偏差應不大于5%。

1.3.2 內標溶液的制備

取庚酸，加三氯甲烷制成每l mL三氯甲烷中含10 mg庚酸的溶液，即得。

1.3.3 測定方法

取供試品，用水準確稀釋成蛋白質含量為40～50 g/L的溶液，即為供試品溶液。精密量取供試品溶液0.5 mL，加內標溶液30 μL與1.5 mol/L高氯酸溶液0.2 mL，于振蕩器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，加蓋，于振蕩器上劇烈混合2 min，以3 000 r/min離心20 min，除去上層水相，小心將三氯甲烷層傾入10 mL試管中，取0.1 μL注入氣相色譜儀。

另精密稱取辛酸對照品0.15 g，置于10 mL容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，即為辛酸對照品溶液。精密量取辛酸對照品溶液10 μL、20 μL、30 μL、40 μL 和 50 μL，分別精密加內標溶液 30 μL，于振蕩器上混合1 min，加三氯甲烷4 mL，同法操作。以各辛酸對照品溶液峰面積與內標溶液峰面積比對各辛酸對照品溶液辛酸量（μg）作直線回歸，求得直線回歸方程，并計算出供試品溶液辛酸絕對量及供試品辛酸鈉含量。

1.3.4 重復性試驗

取人血白蛋白質控品（批號20170421-3）作為供試品，重復測定6次，根據標準曲線計算辛酸鈉含量。

1.3.5 加標回收率試驗

取每1 g蛋白質中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標回收率溶液作為供試品，每個濃度分別制備3份進行測定，根據標準曲線計算辛酸鈉含量。

2 結果與分析

2.1 系統適用性圖譜峰面積的變化

由表1可知，不揮干，直接進樣法（優化后的方法）所得峰面積較小，這是因為優化后方法的辛酸對照品溶液不揮發至干，直接進樣使得濃度變低，峰面積變小，但不影響積分。連續5針辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD值由藥典方法的0.1%變為3.0%，但仍符合系統適用性要求（不大于5%）。實驗時間由2 d縮短為1 d。

表1 系統適用性結果

2.2 重復性試驗比較

由表2可知，方法優化前、后的重復性試驗RSD值分別為4%、2%。對兩組數據進行方差齊性檢驗，F=1.108，P=0.317＞0.05，方差具有齊性，即兩組數據精密度無顯著性差異，表明進樣濃度降低并不影響實驗結果的精密度。

表2 重復性試驗結果（n=6）

2.3 加標回收率試驗比較

由表3可知，藥典方法測得的9次回收率的平均值為97.7%，RSD值為1.70%；不揮干，直接進樣法測得的9次回收率的平均值為99.7%，RSD值為1.55%。對兩組數據進行單因素方法分析，F=7.530，P=0.02＜0.05,兩組數據有顯著性差異。方法優化后準確度更接近100%，這是因為優化后的方法不受揮干速度的影響[3]，進樣溶液比藥典方法均勻，損失量相對較小。

表3 回收率試驗結果

2.4 樣品含量測定

應用優化后的人血白蛋白辛酸鈉含量測定方法，對廣東衛倫生物制藥有限公司生產的6批人血白蛋白（10 g/瓶）進行辛酸鈉含量測定，結果見表4。各批次人血白蛋白中辛酸鈉含量均符合《中華人民共和國藥典》規定，辛酸鈉含量的平均值為0.161 mmol/g蛋白，RSD值為2%，與理論投料量0.160 mmol/g蛋白較接近。

表4 樣品含量測定結果（n=6）

3 結論

本研究優化后的方法不需要將三氯甲烷揮干后再加100 μL三氯甲烷溶解殘渣，縮短了試驗時間，減少了揮發的三氯甲烷對人和環境的影響[4-5]。結果證明，優化后的方法重復性好，準確度較高，適用于人血白蛋白辛酸鈉含量測定。