不同碳源對小球藻生長的影響

杜夢帆，王露

（長治學院 生命科學系，山西長治 046011）

小球藻是一種集眾多優點和經濟價值于一身，極具開發應用潛力的生物質能源，被廣泛應用于環保、農業、醫藥、美容、食品和水產養殖等行業[1]。為充分發揮小球藻的應用價值，最重要的是要提高其生產能力。微藻生長情況受到多種環境因素的影響，如溫度、光強、鹽度、pH和培養基成分等[2]。

培養基中的碳源能為微生物體內有機物質的合成提供碳骨架，也為其生命活動提供必需的能量。不同的碳源參與微生物體內碳代謝的途徑也不盡相同，對于促進微生物生長和油脂儲存的程度也有所差別[3]。謝林靜等[4]對比了葡萄糖和乙酸鈉作為碳源時C.protothecoides型小球藻的生物量，結果表明無論是單一培養或是混合培養，小球藻對葡萄糖的利用率都優于乙酸鈉。梁長利等[5]對比了以葡萄糖、乙酸鈉和蔗糖作為唯一有機碳源時異養小球藻的生物累積量，結果排序為蔗糖＞葡萄糖＞乙酸鈉，并且高濃度葡萄糖和乙酸鈉會抑制其生長。

已有研究表明適中的溫度、光照強度以及堿性環境有助于小球藻迅速繁殖[6-8]，但最適碳源的種類與濃度，因藻種和品質的不同而存在明顯差異。為探究某高品質淡水小球藻的最適碳源種類，通過光密度OD680值、血球計數板和葉綠素含量綜合分析其在不同碳源條件下的生長規律，為后續研究和小球藻的大規模培養提供一些有效的基礎實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用小球藻（Chlorella）由上海光語生物科技有限公司提供。

硝酸鈉、EDTA-Na2、蔗糖，天津奧普升化工有限公司；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、無水碳酸鈉、丙酮，天津市風船化學試劑科技有限公司；硼酸、葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉，天津市凱通化學試劑有限公司；檸檬酸、檸檬酸鐵胺，新鄉市化學試劑廠；鉬酸鈉、硫酸銅，天津市化學試劑四廠；無水氯化鈣，天津市天達凈化材料精細化工廠；硫酸鋅，天津市耀華化學試劑有限責任公司；氯化錳，北京市朝陽區化工四廠；氯化鈷，沈陽市試劑二廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LRH-250A型生化培養箱，廣東泰宏君科學儀器股份有限公司；FA224型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SHZ-D（III）型循環水式真空泵，上海秋佐科學儀器有限公司；BC/BD-1028T型海爾冰箱，青島海爾集團；Centrifuge 5424R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；TU-181OS型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；B204LED型生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司；SX-500型快速自動高壓滅菌鍋，日本TOMY公司。

1.3 小球藻擴培

本實驗采用BG-11培養基擴大培養小球藻，培養基配方參考文獻[1]。取藻液和培養基按照體積比1∶4進行接種，在光照強度為3 000 lx，溫度為25 ℃和光暗比為12 h∶12 h的環境下培養5～7 d，待藻液顏色明顯加深后進行下一次擴培，直至藻液數量滿足后續實驗需求。

1.4 實驗設計

本實驗以不添加任何碳源的培養基作為空白樣。在保證培養基整體碳元素質量不變的前提下，將BG-11培養基配方中的檸檬酸和碳酸鈉分別替換為葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉和蔗糖。取對數生長期的小球藻藻液60 mL分別與60 mL滅菌的不同碳源培養液接種至250 mL的錐形瓶中，在1.3項條件下連續培養7 d。

1.5 測定方法

本實驗以BG-11培養液做空白對照，用分光光度計測其在680 nm下的光密度值（OD680），連續監測7 d后以天數為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制小球藻的生長曲線。同時，培養7 d后用血球板計數法觀察小球藻的數量濃度，并以文獻[9]中的標準方法提取葉綠素，配合分光光度計測定藻液中葉綠素的濃度。每個處理組設置3個平行樣，最終結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 光密度值結果分析

不同碳源培養基的小球藻連續培養7 d后得到如圖1所示的生長曲線。可以看出空白組的小球藻在培養周期內的光密度值趨于穩定，與其他外加碳源的處理組相比長勢較弱，但也未出現衰亡的情況，表明小球藻可以利用大氣中的無機碳滿足其生長需要，但利用率低于各種外加有機碳源。此外，以葡萄糖為碳源的處理組中小球藻長勢最好，在培養周期內小球藻生物量大致呈穩步上升趨勢，蔗糖處理組次之。麥芽糖和淀粉處理組，從第3 d開始小球藻OD680基本相同，生物量緩慢增加隨后進入生長穩定期。

圖1 不同碳源培養基的小球藻的生長曲線

2.2 血球板計數和葉綠素濃度結果分析

培養7 d后，對不同碳源培養基的小球藻進行血球板計數和葉綠素提取測定的結果見圖2。空白樣的小球藻細胞密度和葉綠素累積量都是最小的，進一步證實小球藻在有機碳源培養下的生物量產率更高，而部分無機碳進入細胞后生成的CO32-可能會與基礎培養基中的Ca2+反應生成沉淀，使碳源無法得到有效利用[8]。不同有機碳源處理組小球藻的增殖情況和葉綠素累積量差異較大。就血球計數板結果而言，不同碳源對小球藻生長的促進效果排序為單糖＞淀粉＞二糖，且二糖中麥芽糖高于蔗糖，這與張維國[10]的研究結果是一致的。葡萄糖是最簡單的糖類，可以直接被生物所吸收利用，是培養小球藻最理想的碳源。但對于葉綠素含量來說，葡萄糖作為碳源時，其葉綠素含量僅位于中等水平，這是因為小球藻利用葡萄糖的過程中會產生有機酸和CO2，使得培養體系的pH下降，而pH發生變化不利于葉綠素累積[5,11]。當采用麥芽糖作為唯一有機碳源時，葉綠素累積量最高，可能是因為其pH變化幅度較小。

圖2 不同碳源處理組的血球板計數與葉綠素含量

3 結論

為探究某高品質淡水小球藻的最適碳源，本文通過光密度OD680、血球計數板和葉綠素含量3個參數分析其在不同碳源條件下的生長規律。結果發現，空白組的小球藻生長最為緩慢卻未出現衰亡，表明小球藻可以利用大氣中的CO2作為碳源，但利用率較低；葡萄糖作為唯一碳源時，不利于葉綠素累積，但小球藻生物累積量和細胞密度均優于其他各處理組，因此綜合判斷可認為葡萄糖是培養該品質小球藻最適宜的碳源。