遠志-石菖蒲藥對不同配比對PC12細胞凋亡的影響

邸學，王一博，劉雅晴，王海波，王雯睿

（遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧大連 116600）

石菖蒲是常用的醒腦開竅藥，具有化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智的功效，《本經》稱它“開心孔，補五臟，通九竅，明耳目”，《別錄》謂之“聰耳目，益心智”。遠志亦有安神益智、祛痰開竅的功效，《本經》謂其“利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強志倍力”［1］。因遠志與石菖蒲都具有開竅寧神益智的作用，常配對應用于老年癡呆疾病的治療，并被作為組方用藥的基本結構。

老年癡呆（Alzheimer Disease，AD）在中醫學屬于“呆病”“郁證”“文癡”“善忘”等范疇，中醫認為其病位在腦，與心肝脾肺腎功能失調關系密切。臨床多從益智、化痰、祛瘀、調心、補腎以及開竅等多角度治療，尤其安神益智、化痰開竅法歷來頗受重視，而“遠志-石菖蒲”就是體現這一治法的經典藥對，在開心散、定志丸、定志小丸、遠志散等治療“好忘”的經典方劑中廣泛使用[2-4]。

研究發現，應用遠志-石菖蒲配伍的用量有10.0∶3.0、8.0∶3.0、7.0∶3.0、2.0∶1.0、7.0∶5.0、4.0∶3.0、1.0∶1.0、1.0∶2.5和1.0∶4.0等不同比例[5-6]。國家中醫藥管理局公布的《古代經典名方目錄（第一批）》收錄《備急千金要方》之開心散，組成根據宋校本所載處方確定，但與《新雕孫真人千金方》中所記載的劑量差異較大[7]。張林等[8]通過兩個版本及相關醫籍的文獻研究，對該方的劑量進行了分析考證，認為開心散方劑中遠志-石菖蒲藥量比例應為1∶1。

文獻對遠志、石菖蒲藥對或單味藥及其有效成分的藥理作用研究較多，但有關此藥對間最佳配伍比例及其活性物質作用于AD細胞模型的作用機制還有待進一步探討。本實驗通過遠志-石菖蒲合用對谷氨酸致神經細胞凋亡的保護或營養功能研究，從細胞水平探討遠志-石菖蒲配伍比例和藥效作用，為遠志和石菖蒲藥對的開發利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠志、石菖蒲藥材（批號C161170、C150785），大連權健醫藥公司；PC12細胞，中國醫學科學院基礎醫學研究所；DMEM培養基（批號8121277），Gibco公司；L-谷氨酸、Heochst 33342（批號20180519、20210408），Solarbio公司；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（批號C0222、C0207），Beyotime公司；胎牛血清（批號20110703），浙江天杭生物科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、溴化噻唑藍四氮唑（MTT）、氧化丙啶（PI）（批號L1905092、A1720090、H1902001），阿拉丁公司；無水乙醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

HP-40 CO2培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SJIA-5FE冷凍干燥機，寧波市雙嘉儀器有限公司；ST-360酶標儀，KHB科華生物；80-2離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發公司；Mini Shaker搖床，Kylin-Bell Lab Instruments；Ti-S倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；A60倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液制備

（1）遠志-石菖蒲藥對不同配比樣品液（見表1）。分別取遠志、石菖蒲藥材粉碎，過2號篩。遠志、石菖蒲、遠志-石菖蒲不同配比（1∶1、1∶4）按料液比1∶10（g∶mL）分別加入60%乙醇或蒸餾水，浸泡后加熱回流提取2 h，過濾，得到遠志水提液與醇提液、石菖蒲水提液與醇提液、遠志水提液-石菖蒲醇提液（1∶1）、遠志-石菖蒲（1∶1）醇提液和遠志-石菖蒲（1∶4）醇提液，分別濃縮至約5 g/mL，水提液、醇提液先后置于-20 ℃、-80 ℃冷凍4 h，制成凍干粉備用。

表1 溶液制備方法

取各組凍干樣品，分別加入PBS緩沖液溶解，配制成1.0 mg/mL、3.0 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL的遠志水提（醇提）干粉溶液和石菖蒲水提（醇提）干 粉 溶 液，3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和10.0 mg/mL的遠志水-石菖蒲醇（1∶1）干粉溶液，5.0 mg/mL的遠志-石菖蒲（1∶1）醇提干粉溶液，3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL和 10.0 mg/mL的遠志-石菖蒲（1∶4）醇提干粉溶液。經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

（2）含谷氨酸培養液配制：取谷氨酸適量，加PBS緩沖液溶解，配制成100 mmol/L的溶液，再加10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋至10 mmol/L，經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 細胞培養

PC12細胞置于37 ℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度的培養箱中，在10%胎牛血清的DMEM培養液培養。取對數生長期的PC12細胞，加入0.25%胰酶液消化，加入DMEM培養液終止消化，轉入離心管中，3 000 r/min離心2 min。棄去上清液，加入培養液反復吹打后，將細胞均勻接種于96孔板（2×104cell/孔），繼續培養。

1.3.3 分組給藥

細胞培養12 h后棄去原培養液，分別加入90 μL正常培養液或含谷氨酸培養液，再分別加入10 μL PBS緩沖液或不同配比樣品液，每組設3或6個復孔，繼續培養24 h。

1.3.4 細胞活性檢測

取培養的細胞板，避光加入MTT溶液（5 μg/mL）10 μL，繼續培養4 h，棄去上清液。每孔加入DMSO 100μL，振搖3 min，酶標儀測定492 nm處吸光度值（A）。

細胞活力比=(A給藥組-A模型空白組)/(A正常對照組-A模型空白組)×100%

1.3.5 Hoechst 33342/PI染色

分組給藥后的各組細胞分別加入10μL含500 μg/mL PI的PBS溶液，使其終濃度為50 μg/mL，繼續培養20 min，棄去上清液。PBS溶液沖洗兩次，再加入30 μL Hoechst 33342染色液覆蓋住細胞，室溫避光放置5 min后輕緩吸除染色液，PBS溶液沖洗兩次。熒光顯微鏡下觀察分析。

2 結果與分析

2.1 遠志-石菖蒲不同配比樣品保護作用研究

取遠志-石菖蒲不同配比樣品組及不同濃度組進行細胞活性檢測，以正常細胞組（細胞活力值100%）和谷氨酸損傷模型組（細胞活力值0%）為參照，根據各組吸光度值（n=6）計算細胞活力比，結果見圖1。

圖1 各組樣品溶液保護作用結果圖

結果表明，石菖蒲水提干粉（AW-7.5）在試驗濃度范圍內無抗谷氨酸致細胞損傷作用，石菖蒲醇提取物在濃度7.5 mg/mL（AE-7.5）時抗谷氨酸致細胞損傷的作用效果最好；遠志水提取物濃度和醇提取物在濃度5 mg/mL（PW-5.0和PE-5.0）時，抗谷氨酸致細胞損傷的作用效果最好；遠志水-石菖蒲醇（1∶1）提取濃度5 mg/mL（PWAE1∶1-5.0）和遠志-石菖蒲醇提取物濃度7.5 mg/mL（PEAE1∶4-7.5）時，抗谷氨酸致細胞損傷的作用效果最好。

對比分析5 mg/mL濃度的不同組別樣品抗谷氨酸致細胞損傷的作用效果，發現遠志醇提取物（PE-5.0）、水提取物（PW-5.0）的作用效果略強于石菖蒲的醇提取物（AE-5.0），遠強于石菖蒲的水提取物（AW）；遠志水-石菖蒲醇提取物的作用效果（PWAE1∶1-5.0）略強于遠志-石菖蒲醇提取物（PEAE1∶1-5.0）；遠志-石菖蒲醇提取物（PEAE1∶4-5.0）抗谷氨酸致細胞損傷的作用最強。

遠志醇提取物7.5 mg/mL給藥組（PE-7.5）細胞活力值遠小于遠志醇提取物5 mg/mL（PE-5.0）和遠志水提取物7.5 mg/mL給藥組（PW-7.5）的細胞活力值，其原因可能是醇溶液中遠志皂苷類成分提取率高、成分含量高，在超過一定濃度后該類成分的細胞毒性導致PC-12細胞損傷、活力下降甚至凋亡。石菖蒲的醇提取給藥組細胞活力遠強于石菖蒲的水提取物組，提示醇提取方式可能更適合石菖蒲中相關的藥效活性成分的提取富集。

細胞外谷氨酸濃度增加可激活谷氨酸受體，造成神經元持續興奮，介導細胞Ca2+內流超載，產生大量自由基，形成氧化應激，產生興奮性神經毒性損傷神經細胞。資料表明，遠志水提物可提高機體內抗氧化能力，清除過多的自由基，抑制或減輕細胞過氧化損傷；石菖蒲也具有抗缺氧、清除自由基的作用[3]。遠志-石菖蒲藥對能顯著提高AD模型大鼠腦組織中SOD活力，降低MDA和NO含量，減少氧自由基的產生，加速清除過氧化脂質，減輕氧自由基對腦組織的損傷[9]。結合本研究結果，遠志、石菖蒲抗谷氨酸致細胞損傷作用可能與其所含成分的抗氧化作用有關。遠志皂苷、糖脂等成分（水溶性較強），石菖蒲中細辛醚、丁香酚等活性成分（醇溶性較強）可能通過清除過量自由基、減輕谷氨酸興奮性神經毒性損傷作用維持細胞活力。

2.2 遠志-石菖蒲抑制細胞凋亡作用研究

不同樣品組細胞經Hoechst 33342染色液/PI雙染后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，不同提取方法樣品典型結果如表2所示。

表2 各組細胞凋亡、壞死染色分析結果

結果表明，遠志-石菖蒲合用抑制細胞凋亡作用效果優于遠志、石菖蒲單獨使用；遠志水-石菖蒲醇提取物5 mg/mL（PWAE1∶1-5.0）和遠志-石菖蒲醇提取7.5 mg/mL（PEAE1∶4-7.5）抑制細胞凋亡的效果較好。

遠志水-石菖蒲醇（PWAE1∶1）與遠志-石菖蒲醇（PEAE1∶1）提取物組均能夠明顯抑制細胞凋亡，但遠志-石菖蒲醇提取物5 mg/mL濃度組（PEAE1∶1-5.0）早期凋亡細胞數多于同濃度的遠志水-石菖蒲醇實驗組（PWAE1∶1-5.0），可能是因為醇溶液中遠志皂苷類成分細胞毒性作用因含量增高而增強所致。這也提示在進行開心散、定志丸等含遠志藥材的經典名方劑開發應用時，需注意方劑的加工生產工藝參數優化，既要保證其藥效作用，又要避免其副作用[10-12]。

3 結論

遠志-石菖蒲合用抗谷氨酸致細胞損傷的作用效果優于遠志或石菖蒲單獨使用，說明遠志與石菖蒲配對應用于老年癡呆疾病的治療、作為組方常用對藥是具有科學內涵和藥效物質基礎的。遠志-石菖蒲配伍中石菖蒲所占比例高的實驗組能明顯抑制細胞凋亡，提示遠志與石菖蒲用藥比例應在開心散方劑1∶1比例基礎上，根據藥物活性成分的提取效率、血藥濃度和組織分布情況進行適當調整，以達到減低遠志細胞毒副作用、增強藥物合用整體作用效果的目的。