有機(jī)酸Fe2+與無機(jī)酸Fe2+馴化的保加利亞乳桿菌發(fā)酵特性的比較分析

馬章獻(xiàn)

（潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 200000）

缺鐵是當(dāng)前世界上主要的營(yíng)養(yǎng)問題之一，主要影響育齡婦女、嬰兒與兒童[1-2]。這通常由膳食鐵攝入不足、攝入食物中鐵的利用率低，或兩者兼而有之引起[3]。增加鐵的攝入量是缺鐵人群最主要的改善營(yíng)養(yǎng)狀況的方式[4-8]。乳制品是鈣和磷的主要膳食來源[9]，但它們的鐵含量極低[10-11]。富含鐵的乳品將有助于滿足通常食用更多乳制品的缺鐵高危人群的營(yíng)養(yǎng)需求。目前已有關(guān)于制造富含鐵的乳制品的報(bào)道[12-14]，其中對(duì)鐵強(qiáng)化酸奶的研究較為豐富[15-16]。例如益生菌聯(lián)合富馬酸亞鐵能夠顯著提高缺鐵性貧血患者的治療效果，改善患者貧血癥狀，其中有機(jī)鐵比無機(jī)鐵對(duì)腸胃刺激性小且易于吸收[17-18]。

酸奶在乳制品市場(chǎng)中占據(jù)了較大的比重，攪拌型酸奶作為其中的一種類型，口味多樣、營(yíng)養(yǎng)豐富，越來越受到大家的歡迎[19-20]。酸奶發(fā)酵劑是為制作酸奶和乳酸菌飲料而調(diào)制的特定微生物的培養(yǎng)物[21]，保加利亞乳桿菌是酸奶生產(chǎn)中常用的發(fā)酵劑[22]。

正確選擇合適的鐵源對(duì)于生產(chǎn)富含鐵的酸奶非常重要，本研究分析了不同含F(xiàn)e2+鹽發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)出的保加利亞乳桿菌在接種酸奶發(fā)酵過程中酸度、黏度等發(fā)酵活力參數(shù)，為酸奶的鐵強(qiáng)化以及發(fā)酵劑優(yōu)化選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）LB117，由潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫(kù)提供。

一水葡萄糖，食品級(jí)，阜豐集團(tuán)有限公司；硫酸鎂、硫酸錳與磷酸氫二鉀，食品級(jí)，江蘇紫東食品有限公司；檸檬酸氫二銨，食品級(jí)，南通市飛宇食品科技有限公司；富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵與檸檬酸鐵銨，食品級(jí)，連云港龍?zhí)┩称放淞嫌邢薰荆慌Ｈ饨郏称芳?jí)，山東玉寶生物科技股份有限公司；蛋白胨，食品級(jí)，榮氏生物制品（蘇州）有限公司；酵母膏，食品級(jí)，山東圣琪生物有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BioFlo/CelliGen 115玻璃通氣發(fā)酵罐、5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；DV-C 數(shù)顯黏度計(jì)（S63轉(zhuǎn)子），美國(guó)Brookfield公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，牛肉浸粉10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，吐溫-80 1 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.05 g，用水定容至1 L。

保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，牛肉浸粉2 g，蛋白胨15 g，酵母膏6 g，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，吐溫-80 1g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.05 g，F(xiàn)e2+鹽（富馬酸亞鐵/硫酸亞鐵/檸檬酸亞鐵/檸檬酸鐵銨）0.25 g，用水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

取保加利亞乳桿菌（LB117）脫脂乳凍干管，接入121 ℃滅菌15 min后冷卻至室溫備用的200 mL液體MRS培養(yǎng)基中，三角瓶規(guī)格為500 mL。37 ℃培養(yǎng)15 h，每代接種量為2%，傳3代種子液備用。

1.2.2 馴化傳代培養(yǎng)

分別配制含富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵銨的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基各4 L，編號(hào)為1、2、3、4，121 ℃滅菌15 min后冷卻至37 ℃，接種1.2.1備用種子液，接種量為2%，（37±1）℃培養(yǎng)10～15 h，培養(yǎng)期間控制pH在5.0左右，直到OD值≥8，傳15代種子液備用。

1.2.3 種子液制備

分別配制含富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵銨的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基各4 L和1組不含F(xiàn)e2+鹽的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基4 L，分別編號(hào)1、2、3、4、5，121 ℃滅菌15 min后冷卻至37 ℃，1～4號(hào)接種1.2.2對(duì)應(yīng)編號(hào)的備用種子液，5號(hào)接種1.2.1備用種子液，接種量為2%，（37±1）℃培養(yǎng)10～15 h，培養(yǎng)期間控制pH為5.0左右，直到OD值≥8，發(fā)酵液迅速降溫至10 ℃以下備用。

1.2.4 酸奶制作與指標(biāo)檢測(cè)

取純牛奶（1 L/盒），編號(hào) 1、2、3、4、5，在無菌環(huán)境中接種對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基編號(hào)的1.2.3備用種子液，接種量6%，于42 ℃下恒溫培養(yǎng)。分別于接種時(shí)、接種后每2 h取樣測(cè)定酸度與pH，酸度＞60°T后每0.5 h取樣一次，當(dāng)測(cè)得發(fā)酵乳pH≤4.6且酸度＞70°T后終止發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酸奶黏度并進(jìn)行菌數(shù)計(jì)數(shù)。

（1）菌數(shù)計(jì)數(shù)

取1.0 mL發(fā)酵液加到裝有9.0 mL生理鹽水的試管中混勻，形成10-1濃度的菌懸液。然后從10-1濃度的菌懸液中取1.0 mL菌懸液到另外一個(gè)裝有9.0 mL生理鹽水的試管中混勻，形成10-2濃度的菌懸液，重復(fù)此操作直至得到10-6與10-7濃度的菌懸液。取適宜梯度的菌懸液500 μL到不同的空平板中，再倒入適量的MRS瓊脂培養(yǎng)基，搖晃均勻后做好標(biāo)記置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d左右，待單菌落形成后計(jì)數(shù)[23]。

（2）酸度測(cè)定

采用滴定法測(cè)定酸度。稱取10 mL酸奶，用濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定，換算出酸奶的吉爾涅爾度。

（3）黏度測(cè)定

轉(zhuǎn)速30 r/min，攪拌30 s后用黏度計(jì)測(cè)量讀數(shù)。

（4）感官評(píng)定

以20人的評(píng)價(jià)小組對(duì)酸奶進(jìn)行評(píng)分檢驗(yàn)。評(píng)價(jià)內(nèi)容為拉絲性、氣味、滋味、細(xì)膩度、稠厚感、爽滑度、好感度，每個(gè)指標(biāo)滿分均為20分。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan氏新復(fù)極差法（SSR法）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌種子液活菌數(shù)測(cè)定

以保加利亞乳桿菌種子液活菌數(shù)為考察對(duì)象，可以發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌富馬酸亞鐵組最高，無機(jī)酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌活菌數(shù)與對(duì)照組相近，且均較低（見表1）。

表1 保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)

通過計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，無機(jī)酸Fe2+對(duì)活菌數(shù)沒有顯著影響，有機(jī)酸Fe2+馴化后活菌數(shù)顯著增加，且富馬酸亞鐵組增長(zhǎng)效果最好，表明有機(jī)酸Fe2+馴化是保加利亞乳桿菌增殖因子，可促進(jìn)保加利亞乳桿菌的增長(zhǎng)[18]。

2.2 對(duì)酸奶黏度的影響

黏度是反映酸奶質(zhì)量的重要指標(biāo)，它是乳成分在發(fā)酵及貯運(yùn)過程中發(fā)生變化的直接體現(xiàn)，影響酸奶的感官質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，保加利亞乳桿菌將乳糖和葡萄糖、果糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔古Ｄ蘰H由6.5降低至4.6以下，使酪蛋白和乳清蛋白聚集凝固并包裹住水和脂肪。體系中顆粒的大小是影響?zhàn)ざ鹊囊粋€(gè)重要因素，酪蛋白凝固使體系內(nèi)顆粒直徑急劇增加，其形成的膠狀結(jié)構(gòu)限制了水的自由活動(dòng)，且酪蛋白的沉淀及保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖等均可導(dǎo)致發(fā)酵乳的黏度增加。

添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對(duì)發(fā)酵乳的黏度影響見圖1。由圖1可知，發(fā)酵乳的黏度排序?yàn)?號(hào)組＞3號(hào)組＞4號(hào)組＞5號(hào)空白對(duì)照組，2號(hào)組與5號(hào)空白對(duì)照組非常接近。有機(jī)鐵Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶黏度高于空白對(duì)照組，而無機(jī)酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶黏度與空白對(duì)照組非常接近，說明有機(jī)Fe2+（富馬酸亞鐵、檸檬酸亞鐵與檸檬酸鐵銨）馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶在酸奶感官質(zhì)量方面有一定優(yōu)勢(shì)，推測(cè)在馴化過程中菌株胞外多糖生產(chǎn)能力有所提高，改變菌種發(fā)酵黏度極低的特點(diǎn)，增強(qiáng)了酸奶質(zhì)構(gòu)。

圖1 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的黏度

2.3 對(duì)發(fā)酵時(shí)間的影響

產(chǎn)酸快慢決定著發(fā)酵周期的長(zhǎng)短，產(chǎn)酸能力反映菌株的發(fā)酵活力[24]。發(fā)酵時(shí)間是評(píng)價(jià)發(fā)酵菌活力的重要指標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間越短越有利于企業(yè)節(jié)省成本、提高效率。添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對(duì)發(fā)酵時(shí)間的影響見圖2。對(duì)比發(fā)現(xiàn)對(duì)照組發(fā)酵速度最慢，說明用有機(jī)酸Fe2+與無機(jī)酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌都可有效增加發(fā)酵活力，縮短酸奶發(fā)酵時(shí)間，其中富馬酸亞鐵的效果最明顯（P＜0.05）。

圖2 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間

2.4 對(duì)酸奶活菌數(shù)的影響

益生菌發(fā)揮相應(yīng)的功效必須以活菌數(shù)為先決條件[25]。酸奶在發(fā)酵完成后于4 ℃冷藏，在這樣的低溫下，乳酸菌等益生菌處于休眠或半休眠狀態(tài)，所以活菌酸奶只要嚴(yán)格低溫保存，在保質(zhì)期內(nèi)其口感可基本保持一致。添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對(duì)酸奶發(fā)酵終點(diǎn)（pH4.5）時(shí)活菌數(shù)的影響見圖3，1號(hào)組、3號(hào)組與4號(hào)組活菌數(shù)顯著高于5號(hào)空白對(duì)照組和2號(hào)組，即有機(jī)酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌比無機(jī)酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌在功效發(fā)揮方面有一定優(yōu)勢(shì)。

圖3 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的活菌數(shù)

2.5 發(fā)酵過程中酸度變化對(duì)比

乳酸可促進(jìn)乳蛋白的吸收，抑制腸內(nèi)病原性微生物的生長(zhǎng)，酸奶中由乳酸產(chǎn)生的酸度能增進(jìn)產(chǎn)品的風(fēng)味，增加人的食欲[26]。添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對(duì)酸度的影響見圖4，產(chǎn)酸速度排序?yàn)?號(hào)組＞3號(hào)組＞2號(hào)組＞4號(hào)組＞5號(hào)組（空白對(duì)照），說明用有機(jī)酸Fe2+與無機(jī)酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌都可高效產(chǎn)生乳酸，發(fā)酵速度快。

圖4 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵期間酸度變化

2.6 發(fā)酵過程中pH變化對(duì)比

發(fā)酵酸奶中的pH隨著乳酸的產(chǎn)生不斷下降，反映出保加利亞乳桿菌在發(fā)酵乳中的活躍程度，添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對(duì)酸奶發(fā)酵pH的影響見圖5，1號(hào)組pH下降最迅速，4號(hào)組與5號(hào)組（空白對(duì)照）比較接近，其趨勢(shì)與酸度產(chǎn)生的速度基本符合；當(dāng)pH降低至4.5左右時(shí)，所有菌種都會(huì)受到發(fā)酵產(chǎn)物的抑制，pH不再變化。

圖5 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵期間pH變化

2.7 酸奶感官評(píng)定結(jié)果

感官評(píng)定結(jié)果見圖6，在拉絲性、滋氣味、稠厚感、好感度等方面，1號(hào)組評(píng)價(jià)最好，2號(hào)組與5號(hào)組在爽滑度和細(xì)膩度方面評(píng)價(jià)較好，與上述各指標(biāo)評(píng)價(jià)結(jié)果相互印證。總體來看，使用富馬酸亞鐵培養(yǎng)馴化后的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶，有利于改善感官品質(zhì)。

圖6 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的感官評(píng)定

3 結(jié)論

鐵在生物生理過程（特別是線粒體呼吸作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的形成以及核酸的合成方面）起著關(guān)鍵作用，因此許多微生物的增殖等生命活動(dòng)取決于鐵的活性[27-29]。本文對(duì)有機(jī)酸Fe2+（富馬酸亞鐵、檸檬酸亞鐵與檸檬酸鐵銨）與無機(jī)酸Fe2+（硫酸亞鐵）分別馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵活力進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明，用有機(jī)酸Fe2+與無機(jī)酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌都可有效增加發(fā)酵活力，縮短酸奶發(fā)酵時(shí)間，其中接種6%富馬酸亞鐵馴化傳代的保加利亞乳桿菌種子液時(shí)，酸奶發(fā)酵時(shí)間最短，產(chǎn)酸和產(chǎn)黏能力最強(qiáng)，酸奶活菌數(shù)最高，發(fā)酵活力最強(qiáng)。增進(jìn)酸奶風(fēng)味方面無機(jī)酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌要遜色一些，而經(jīng)過有機(jī)酸Fe2+（富馬酸亞鐵）馴化的菌株發(fā)酵活力增強(qiáng)后，對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)也明顯增強(qiáng)，為酸奶的鐵強(qiáng)化以及發(fā)酵劑優(yōu)化選擇提供參考。