敲低、過表達NCOA4慢病毒包裝及穩轉HFL1細胞株構建

黃德林，陳雅慧，凡志婷，石祥廣，黃炎，王少輝，王久存，姜帥

（復旦大學 生命科學學院，上海 200438）

細胞死亡是所有真核生物的共同特征，對保持細胞和機體正常生長發育有著至關重要的作用。科學家根據細胞死亡時不同的形態學特征提出了壞死性凋亡、自噬性死亡、焦亡和鐵死亡等細胞死亡類型[1-2]。鐵死亡（ferroptosis）是2012年DIXON等學者發現的一種新的調節性細胞死亡（Regulatory Cell Death，RCD）形式，在多種疾病中扮演重要角色[3]。目前已發現鐵死亡在肺纖維化、肺癌、慢性阻滯性肺病（COPD）、急性肺損傷、肺結核等肺部疾病中發揮重要作用[4]。

鐵死亡是一種區別于傳統細胞死亡形式的全新細胞死亡方式。鐵死亡的典型特征是依賴于鐵過載導致的細胞脂質過氧化[5]。鐵的吸收主要來源于膳食，小腸吸收鐵離子轉運進入細胞后被還原為二價鐵離子，過量二價鐵離子會催化細胞發生脂質過氧化而死亡。伴隨鐵過載引發的脂質過氧化所催化的細胞死亡方式，被稱為鐵死亡[6]。隨著工業化進程加速，人類活動和環境破壞導致惡性和非惡性呼吸系統疾病的發病率急劇上升，而鐵死亡的發現可能為解決呼吸系統疾病提供新思路。

核受體共激活因子4（Nuclear Receptor Coactivator 4，NCOA4）介導鐵自噬（ferritinophagy）的激活，在鐵代謝過程中扮演重要角色[7-8]。鐵蛋白（ferritin）是細胞內儲存鐵的重要方式，研究發現NCOA4可以識別結合鐵蛋白[9]，二者形成的蛋白復合體可以被自噬溶酶體識別并降解釋放出游離鐵，重新參與機體鐵代謝循環，游離鐵過量則會促進鐵死亡的發生[10-12]。NCOA4介導的鐵死亡對肺部細胞功能的影響尚待闡明，本研究旨在通過構建敲低、過表達人NCOA4慢病毒載體，感染目的細胞獲得敲低、過表達NCOA4的人胚肺成纖維細胞（HFL1）穩轉株，為研究NCOA4介導的鐵死亡在肺部疾病中的作用機制提供工具細胞。

1 材料與方法

1.1 試劑

PCR引物、DEPC水，生工生物工程（上海）股份有限公司；NCOA4引物，賽音生物技術（上海）有限公司；PCR 酶、AgeⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ，美國New England Biolabs公司；TaqManTMMicroRNA逆轉錄試劑盒、DMEM、胰酶、青霉素／鏈霉素、嘌呤霉素、低內毒素質粒抽提試劑盒、DNA快速回收試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司；DNA marker，翌圣生物科技（上海） 股份有限公司；SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ試劑，日本Takara公司；TEMED，美國Sigma公司；HFL1細胞，美國ATCC公司。

1.2 儀器

BCD-118TMPA型冰箱，海爾（上海）電器有限公司；MricroCL 21離心機、QuantStudio 7實時定量PCR儀、Heraguard ECO超凈工作臺，美國Thermo Fisher Scientific公司；MCO-20AIC細胞培養箱，日本Panasonic公司；Lecia DMR熒光顯微鏡，德國Fecialeica公司；Gel Doc XR+自動曝光儀，美國BIORAD公司；HW24水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 敲低、過表達載體的構建

1.3.1.1 設計NCOA4的shRNA和PCR引物

依據人NCOA4的cDNA序列以及pLKO.1、pCDH載體的酶切位點設計相應的shRNA和PCR引物。為保證實驗準確性，本研究設計了2對shRNA（如表1所示），2對PCR引物（如表2所示），由賽音生物技術（上海）有限公司合成。

表1 NCOA4的shRNA

表2 NCOA4的PCR引物

1.3.1.2 NCOA4敲低、過表達慢病毒包裝載體雙酶切

（1）慢病毒包裝質粒轉化大腸桿菌感受態DH5-α，擴增后提取目的質粒。（2）檢測質粒濃度后，取1 μg質粒，根據酶切位點選擇合適的限制性內切酶雙酶切目的質粒。酶切體系如下：1 μg質粒，10×NEB buffer 5 μL，pLKO.1載體加EcoRⅠ、AgeⅠ各1 μL（pCDH載體加EcoRⅠ、NotⅠ各1 μL），加ddH2O至總體積為50 μL，37 ℃酶切4 h。（3）瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物，回收目的片段的膠條并檢測濃度。

1.3.1.3 shRNA退火和目的基因PCR擴增

（1）將合成的shRNA和引物稀釋成終濃度為5 μmol/mL的儲藏液。（2）shRNA退火：正向、反向shRNA及10×NEB buffer 2各5 μL，加ddH2O至總體積50 μL，95 ℃加熱5 min，梯度降溫。（3）PCR擴增：正向、反向引物及高保真酶各5 μL，加ddH2O至總體積50 μL。94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次。（4）結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的基因。

1.3.1.4 目的基因與載體連接

測定步驟1.3.1.2和1.3.1.3中回收的載體和目的基因的濃度，分別將退火后的shRNA與pLKO.1片段連接，將擴增的NCOA4基因與pCDH片段連接。連接體系：插入片段100 ng，線性化克隆載體500 ng，NEB T4 DNA ligase 2 μL，10×NEB T4 DNA ligase buffer 2 μL，ddH2O定容至20 μL。16 ℃連接過夜。

1.3.1.5 重組質粒的轉化擴增、測序

取2 μL重組質粒，用移液槍轉移至大腸桿菌DH5-α感受態細胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴鍋熱激50 s，然后迅速置于冰上5 min。加入300 μL無抗生素培養基，37 ℃振蕩培養2 h。3 000 r/min離心5 min，棄掉200 μL上清液，剩余液體吹打均勻，在含抗生素的LB培養板中涂勻，37 ℃培養箱內倒置培養過夜。挑取單克隆擴大培養，提取質粒后測序，測序正確即可進行慢病毒包裝。

1.3.2 慢病毒包裝感染HFL1構建穩轉株1.3.2.1 包裝慢病毒

本實驗采用Addgene公司的三質粒包裝體系。（1）在6 cm皿中鋪板293T細胞，待長到80%時，更換新鮮培養基。（2）取靶基因質粒4 μg，psPAX2（Addgene #12260）3 μg，pMD2.G（Addgene#12259）1 μg加入到500 μL無血清opti-MEM中配制溶液A；同時取16 μL Lipo2000加入到500 μL無血清opti-MEM中配制溶液B；分別靜置5 min。（3）混合溶液A、B，靜置20 min，將混合后的溶液加入到293T細胞中。12 h后換液，并添加丁酸鈉至終濃度為5 μmol/L。（4）48 h后培養基變黃，證明病毒包裝成功，收集上清，用0.45 μm濾膜過濾。收集到的病毒溶液離心純化后，-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3.2.2 確定嘌呤霉素最佳篩選濃度

第1天：將HFL1鋪板于10個6 cm的培養皿中，37 ℃、5% CO2條件下過夜培養。第2天：靶細胞應有約80%～90%匯合。嘌呤霉素的最終濃度為1～10 μg/mL，增量為1 μg/mL，分別標記為1～10號平板，并向細胞中添加適當的含有嘌呤霉素的培養基。第3天及以后：每天檢查細胞，24 h后更換含嘌呤霉素的新鮮DMEM完全培養基。最佳嘌呤霉素篩選濃度為3～5天后細胞完全死亡的嘌呤霉素濃度，也是實驗中應用于篩選細胞的濃度。最終確定HFL1嘌呤霉素的最佳篩選濃度為1 μg/mL。

1.3.2.3 慢病毒感染HFL1和穩轉細胞株的篩選

第1天：鋪板HFL1細胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養過夜。第2天：靶細胞應有約70%匯合。慢病毒顆粒溶液，對于6 cm靶板，添加0.5～1.0 mL病毒（高MOI添加0.5 mL，低MOI添加1.0 mL，根據目標板的大小調整病毒添加量）。添加聚凝胺至終濃度為8 μg/mL，37 ℃、5%CO2條件下培養細胞過夜。第3天：感染24 h后更換新鮮培養基。如果在細胞系中觀察到病毒毒性，可以將感染時間減少到4～20 h，清除含有病毒的培養基，并更換為新的培養基。建議保持一個未感染病毒的平行細胞孔板作為嘌呤霉素篩選的對照組。第4天及以后：每隔48 h根據細胞生長狀況更換含有嘌呤霉素的新鮮培養基。持續篩選14天后檢測NCOA4的表達情況。

1.4 qPCR檢測穩轉細胞株NCOA4的表達

（1）收集細胞，加Trizol充分裂解后提取總RNA。取1 μg的RNA，加DEPC水定容至7 μL，再加入1 μL 10×RT buffer，1 μL random primers，0.5 μL dNTP，0.5 μL反轉錄酶。混勻后按照25 ℃，5 min；37 ℃，2 h；85 ℃，5 min；4 ℃+∞完成逆轉錄獲得cDNA。（2）獲取的cDNA用ddH2O稀釋10倍，qPCR定量。體系包括稀釋后的cDNA 2 μL，濃度為2 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，SYBR Mix 2 μL。反應條件：95 ℃，40 s；95 ℃，30 s；60 ℃，60 s；72 ℃，30 s；重復36個循環。

1.5 Western Blot檢測穩轉細胞株NCOA4的表達

收集細胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min。轉移至離心管，加5×的loading buffer染色，100 ℃金屬浴10 min，然后迅速置于冰上冰浴，防止蛋白復性。收集處理后的蛋白SDS-PAGE電泳至溴酚藍跑出蛋白凝膠底部，進行轉膜。轉膜后用5%BSA封閉2 h，孵育一抗過夜，第二天洗膜，孵育二抗2 h，再次洗膜后顯影。

1.6 統計分析

序列比對使用軟件DNAMAN 9.0。打開軟件后選擇要添加的NCOA4基因序列、NCOA4的shRNA、克隆載體測序數據。導入序列后選擇Multiple Sequence Alignment，參數全部保持默認。

差異性分析使用軟件GraphPad Prism 9.0，使用方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 NCOA4敲低、過表達載體

pLKO.1長7 091 bp，shRNA1長58 bp。在雙酶切掉一個約1 900 bp片段的位置連接上shRNA，獲得目的載體長約5 200 bp。pCDH長7 384 bp，NCOA4基因片段長1 890 bp，因此連接上NCOA4片段后長約9 200 bp。如圖1所示，核酸電泳顯示重組載體在相應分子量位置出現，在相同條件下環狀質粒比線性質粒運動更快，酶切鑒定與預期相符。如圖2所示，測序結果顯示shRNA1（KO1）成功連到pLKO.1載體上，NCOA4基因片段成功連到pCDH載體上。

圖1 目的基因質粒的酶切電泳

圖2 目的基因質粒的測序

2.2 敲低、過表達NCOA4的HFL1穩轉細胞系

用包裝好的NCOA4敲低、過表達慢病毒感染HFL1細胞，得到敲低、過表達NCOA4的HFL1穩轉株。如圖3、圖4所示，經qPCR和Western Blot檢測發現NCOA4實現了穩定低表達和高表達，成功構建NCOA4敲低、過表達的HFL1細胞系。

圖3 穩轉細胞系中NCOA4蛋白表達情況

圖4 穩轉細胞系中NCOA4的mRNA相對表達量

4 結論

鐵死亡與肺纖維化、肺癌、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等多種肺部疾病發生發展密切相關[13]。研究表明，特發性肺纖維化（IPF）患者肺中的總鐵水平、鐵相關氧自由基均有所增加[14]；Fer-1可以通過抑制鐵死亡進而抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化[15]。正常HFL1能夠活化形成腫瘤相關成纖維細胞（CAFs），促進肺癌的發生發展[16]。COPD常伴隨成纖維細胞過度增殖，正常的組織結構破壞，并發間質性肺纖維化，誘導成纖維細胞發生鐵死亡，可能為COPD的治療提供新思路[17]。NCOA4介導的鐵死亡與肺部疾病的研究尚處于早期階段，大部分研究僅揭示了呼吸系統疾病中存在鐵死亡現象，但其具體機制尚不明確。深入探究鐵死亡與疾病發生發展的具體機制，有助于加深對肺部疾病的認識，為肺部疾病提供更精準的治療[18-19]。

基于此，使用基因工程技術構建了NCOA4敲低、過表達慢病毒包裝質粒，通過慢病毒三質粒包裝系統包裝敲低、過表達NCOA4慢病毒感染顆粒，并確定了HFL1的嘌呤霉素最佳篩選濃度為1 μg/mL。慢病毒感染目的細胞2～3天后，嘌呤霉素篩選2周，獲得了敲低、過表達NCOA4的HFL1穩轉株，為深入研究NCOA4介導的鐵自噬引發的鐵死亡在肺部疾病中發揮的作用提供了一個優良的細胞模型。