玫瑰花標準湯劑及配方顆粒指紋圖譜和含量測定研究

韓慧琴，徐 鵬，賀麗霞，尹貽珍

（張家口市食品藥品檢驗中心，河北 張家口 075000）

中藥配方顆粒是通過現代制藥技術，以中藥飲片為原料，經提取、過濾、干燥、制粒等系列過程制備而成的顆粒劑，其有效成分、性味、歸經、主治、功效和傳統中藥飲片完全一致，保持了傳統中藥飲片的全部特征，既能保證中醫傳統的“君、臣、佐、使”和辨證論治、靈活加減的特點，優于中成藥，又免去了傳統煎煮的麻煩，同時還可靈活地以單味顆粒沖服，衛生有效[1～4]。中藥配方顆粒在國內的應用時間還比較短，仍需大力推廣[5]。主要因為我們起步比較晚，大量的基礎工作需要從頭開始。從質量標準來看，目前檢驗項目還不是很全面，特別是安全性方面還有待提高。玫瑰花為薔薇科植物玫瑰（Rosa rugosaThunb）的干燥花蕾，具有行氣解郁、和血、止痛的功效[6，7]，為常用藥材。玫瑰花配方顆粒目前無統一的國家標準，關于特征圖譜的研究有一篇報道[8]，但其以沒食子酸為參照物。本實驗參考有關文獻[9～11]以槲皮素為參照建立了指紋圖譜和槲皮素與山柰素的含量測定方法。可為玫瑰花配方顆粒的質量評價和真偽鑒別提供依據。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT-PDA型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters e2695-2998-PDA型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；“藥典委中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版本）”；SPSS-19.0統計軟件；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯，精度：0.01 mg）；C9860A型超聲波清洗器（CBL Photoelectron technology）；槲皮素標準品（批號：100081-201610）與山柰素標準品（批號：110861-202013）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇及磷酸為色譜純；水為超純水。15批飲片分別購自甘肅（3批）、廣東（3批）、福建（3批）、浙江（3批）和山東（3批）5個省區，自制標準湯劑，批號分別為TJ01-TJ15。收集玫瑰花配方顆粒2個廠家共3批樣品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱均為C18（5μm，250 mm×4.6 mm I.D.），分 別 采 用YMC-Pack、Waters Symmetry、Agilent、Inertsil和BOS HYPERSIL5個生產廠家的色譜柱。流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）（見表1）。

表1 檢測條件

2.2 標準湯劑及溶液制備

2.2.1 標準湯劑的制備 取15批次玫瑰花藥材各200 g，分別加水2400 mL，浸泡30 min，煎煮20 min，過濾，取濾渣加水2000 mL，煎煮15 min，用100目篩過濾，合并濾液，于50℃減壓濃縮，低溫干燥，得干浸膏，15批次平均出膏96.4 g，平均出膏率為48.2%。

2.2.2 對照品溶液 取槲皮素12.44 mg與山柰素10.67 mg，加甲醇制成每1 mL含槲皮素248.8μg、山柰素213.4μg的混合溶液。

2.2.3 供試品溶液 取標準湯劑或供試品，研細（過四號篩），取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min放冷過濾，分別精密量取濾液5 mL、加入70%甲醇5 mL、25%鹽酸溶液5 mL，加熱回流1 h放冷，定容至25 mL量瓶中搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.3 含量測定方法學考察

2.3.1 專屬性實驗 取對照品溶液、供試品溶液各20μL注入液相色譜儀，結果槲皮素、山柰素與其他組分的分離度均＞1.5，且峰型好（見圖1）。

圖1 HPLC色譜圖 （A）槲皮素 （B）槲皮素和山柰素混合對照品 （C）標準湯劑 （D）市售樣品3.槲皮素峰；5.山柰素峰

2.3.2 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用移液槍分別精密量取2、5、10、50、100μL，分別加甲醇定容至1.0 mL，配制成系列濃度的標準溶液。分別取20μL注入液相色譜儀，以濃度C（μg·mL-1）為橫坐標、以峰面積A為縱坐標繪制標準曲線，槲皮素與山柰素的回歸方程分別為A=75273 C-95427（r=0.9999），A=72283C-24833（r=0.9999），槲皮素與山柰素的線性范圍分別為0.4976～24.88μg·mL-1和0.4268～21.34μg·mL-1。

2.3.3 準確度實驗 分別精密稱取玫瑰花標準湯劑（批號：TJ01）9份，每份約0.6 g，分別加入一定量的槲皮素與山柰素對照品，按“2.2.3”項下的方法制成供試品溶液。按上述檢測方法測定，計算回收率。結果表明，各指標成分回收率RSD值均＜3.0%，實驗數據見表2、表3。

表2 槲皮素回收率實驗結果（n=9）

2.3.4 精密度實驗 取“2.2.3”項下的同一供試品溶液（批號：TJ01），連續進樣6次，進行測定。槲皮素與山柰素峰面積的RSD分別為0.5%和0.4%，均＜2.0%。

2.3.5 重復性實驗 取同一批玫瑰花標準湯劑（批號：TJ01），照“2.2.3”項下的方法制備6份供試品溶液進行分析。結果槲皮素和山柰素含量的RSD分別為0.2%和0.3%，均＜2.0%。

2.3.6 穩定性實驗 取同一批供試品溶液（批號：TJ01），分別于0、1、2、3、6、12、18、24、48 h進樣9次，結果槲皮素含有量的RSD為0.6%，山柰素含量的RSD為0.2%，均＜2.0%。

2.3.7 耐用性實驗 采用2個廠家的高效液相色譜儀、5個廠家的色譜柱按擬定的方法測定，結果槲皮素含有量的RSD為1.2%，山柰素含量的RSD為1.4%，均＜2.0%。

2.3.8 樣品的測定 取15批玫瑰花標準湯劑及2個廠家的玫瑰花配方顆粒3批，按前述“2.2.3”項下的方法操作，制成供試品溶液，按上述檢測方法測定，計算樣品的含量，結果見表4。15批玫瑰花標準湯劑槲皮素含量為4.76~6.84 mg·g-1，山柰素含量為1.56~2.13 mg·g-1。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

分別精密吸取不同批次（TJ01-TJ15）的玫瑰花標準湯劑供試品溶液、玫瑰花配方顆粒3批樣品供試品溶液、槲皮素與山柰素的混合對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，按“2.1”的色譜條件測定，記錄色譜圖（見圖1）。將15批樣品的實驗數據導入“藥典委中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012.130723版本），采用中位數法對不同樣品的指紋圖譜進行峰點校正，數據匹配分析，生成對照指紋圖譜（見圖2、圖3），指定5個共有峰為特征峰，并用對照品圖譜進行定位，確定3號峰為槲皮素，5號峰為山柰素。以3號峰（槲皮素）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積（結果見表5、表6）。15批玫瑰花標準湯劑與對照指紋圖譜的相似度分別為0.978、0.993、0.997、0.995、0.996、0.992、0.993、0.997、0.996、0.979、0.987、0.997、0.993、0.978、0.997。相似度評價表明，15批標準湯劑指紋圖譜和對照品指紋圖譜的相似度良好；3批玫瑰花配方顆粒與對照指紋圖譜的相似度分別為0.993、0.997和0.987。

圖2 15批玫瑰花標準湯劑對照指紋圖譜

圖3 15批玫瑰花標準湯劑指紋疊加圖譜

表5 15批玫瑰花標準湯劑共有峰的相對保留時間

表6 15批玫瑰花標準湯劑共有峰的相對峰面積

2.5 指紋圖譜方法學考查

2.5.1 精密度實驗 取供試品溶液（批號：TJ01），連續測定6次，以3號峰（槲皮素）為參照峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果5個共有峰的相對保留時間RSD與相對峰面積RSD均＜2.0%。

2.5.2 重復性實驗 照“2.3”項下的方法制備供試品溶液6份進行分析。結果5個共有峰的相對保留時間RSD與相對峰面積RSD均＜2.0%。

2.5.3 穩定性試驗 取供試品溶液（批號：TJ01），照“2.1”項下色譜條件，分別于0、1、2、3、6、12、18、24、48 h進樣9次，以3號槲皮素峰為參照峰，計算5個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果均＜2.0%。

3 討論

3.1 實驗過程中考察了甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇4種提取溶劑的提取效率，比較了酸水解前后各成分的含量差異；考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸等流動相系統，考察了高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀的檢測效果，最終確定了文中的方法，該條件下色譜峰信息豐富、分離度好、穩定性高，可以作為控制玫瑰花配方顆粒的方法。

3.2 對比相似度較小樣品與其他樣品的指紋圖譜，發現其共有峰相對保留時間比較一致，主要差異表現在色譜峰的面積上，即含量的差異。這表明不同產地樣品的質量有一定差異，同一產地樣品質量無明顯差異。

3.3 采用建立的含量測定方法和指紋圖譜方法對市售2個廠家3批次樣品進行檢測，含量測定結果與標準湯劑一致，指紋圖譜的相似度也與標準圖譜一致，說明市售樣品的質量較好。

3.4 從含量測定結果可知，相同產地槲皮素和山柰素的含量基本一致，不同產地的含量略有差別，可能與氣候、土壤和生長環境有關。

3.5 本實驗通過指紋圖譜相似度評價對不同產地的玫瑰花標準湯劑的指紋圖譜進行了定性、定量評價，并對市售樣品進行測定，并評價其質量。研究結果表明，本方法具有良好的專屬性和準確性，可作為玫瑰花配方顆粒的定性定量分析方法。

3.6 用建立的方法對市售2個廠家3批次樣品進行測定，結果表明，不同廠家的樣品指紋圖譜比較一致，相似度都在0.98以上，但峰面積仍存在著差異，說明各廠家的生產工藝和藥材來源可能不盡相同。