基于網絡藥理學和分子對接研究丹參-赤芍藥對治療結直腸癌的作用機制

王方園，王 棟，孔憲斌，時浩洋，趙 爽，楊玉瑩，孟靜巖*

基于網絡藥理學和分子對接研究丹參-赤芍藥對治療結直腸癌的作用機制

王方園1，王 棟1，孔憲斌2，時浩洋1，趙 爽1，楊玉瑩1，孟靜巖2*

1. 天津中醫藥大學研究生院，天津 301600 2. 天津中醫藥大學中醫學院，天津 301600

基于網絡藥理學和分子對接技術探究丹參-赤芍藥對治療結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的作用機制，并進一步運用體外細胞實驗進行驗證。通過TCMSP數據庫篩選出丹參-赤芍藥對活性成分及其對應的靶點，通過檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫檢索獲得CRC相關靶點，將丹參-赤芍活性成分靶點與CRC靶點取交集，采用Cytoscape 3.8.2軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡，運用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，運用R語言進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；選取關鍵靶點及核心活性成分，使用AutoDock軟件進行分子對接。通過體外細胞實驗驗證網絡藥理學結果，分別采用MTT及劃痕實驗檢測丹參-赤芍藥對對HCT116細胞增殖及遷移能力的影響，采用qRT-PCR及Western blotting檢測丹參-赤芍藥對對網絡藥理學核心靶點表達的影響。網絡藥理學預測顯示，丹參-赤芍藥對活性成分206個，共有352個對應的靶基因，CRC疾病相關靶點9143個，得到交集靶點283個。通過PPI網絡篩選得到丹參-赤芍藥對治療CRC的關鍵治療靶點3個：雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、黏著連接蛋白β1（catenin β1，CTNNB1）和視網膜母細胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）。GO功能和KEGG通路分析顯示，關鍵靶點涉及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、p53信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、細胞凋亡等。分子對接結果顯示關鍵靶點與重要活性成分結合構象穩定，篩選出丹參-赤芍藥對治療CRC的核心活性成分主要是黃芩苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷等。MTT及劃痕實驗表明，丹參-赤芍藥對對HCT116細胞增殖和遷移能力具有明顯的抑制作用（＜0.05、0.01）；丹參-赤芍藥對顯著抑制和mRNA表達水平（＜0.05、0.01），顯著上調mRNA表達水平（＜0.05）；顯著下調ESR1、β-catenin、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）和聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）蛋白表達水平（＜0.05、0.01），顯著上調RB1蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。丹參-赤芍藥對可能作用于ESR1、CTNNB1和RB1等靶點，通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路等相關通路，從而抑制CRC細胞的增殖和遷移能力。

丹參-赤芍藥對；結直腸癌；網絡藥理學；分子對接；雌激素受體1；黏著連接蛋白β1；視網膜母細胞瘤基因1

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統惡性腫瘤，在最新統計的全球癌癥發病率和死亡率排名中均位居前列[1]，其高發病率和高死亡率嚴重威脅人們的生命健康。CRC的發生、發展機制復雜，其中涉及多種腫瘤相關基因及腫瘤相關信號通路的改變。

近年來，中藥以其多途徑、多靶點的優勢，在輔助治療CRC方面取得了良好的療效。丹參-赤芍是臨床上抑制惡性腫瘤發生發展常用的活血化瘀藥對，其中，丹參是唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，《本草綱目》草部中記載其味苦，性微寒，無毒，歸心、肝經，具有祛瘀生新、活血止痛的功效[2]。赤芍是為毛茛科植物芍藥Pall.或川赤芍Lynch的干燥根，味苦，性微寒，歸肝經，具有清熱涼血、活血祛瘀的功效[3]。本研究基于網絡藥理學及分子對接技術篩選丹參-赤芍藥對治療CRC的相關靶點和通路，并將篩選后的活性成分與靶蛋白進行分子對接，探討丹參-赤芍藥對是否能夠多靶點、多途徑抑制CRC的發生發展，并運用體外細胞實驗對相關靶點進行驗證，以期為中醫藥防治CRC提供新思路。

1 材料

1.1 細胞

結直腸癌HCT116細胞購自ATCC細胞庫。

1.2 藥材

丹參（批號20190513）、赤芍（批號20190411）均購自北京同仁堂股份有限公司，經天津中醫藥大學孟靜巖教授鑒定分別為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖、毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根。

根據孟靜巖教授多年臨床經驗，丹參-赤芍藥對以1∶1配伍制成凍干粉，將凍干粉溶解于無血清培養基，配制成2 mg/mL的溶液（以生藥量計），通過0.22 μm濾器滅菌，將滅菌后的藥液保存在?20 ℃備用。本課題組前期利用UPLC-Q-TOF/MS技術對丹參-赤芍活性成分進行鑒定[4]，篩選出18種丹參獨有成分及11種赤芍的獨有成分，如丹參素、苯甲酰芍藥苷、芍藥苷等。

1.3 藥品與試劑

MTT（批號M8180）、高效RIPA裂解液（批號R0010）、PMSF（批號P0100)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號P1261）購自北京索萊寶科技有限公司；細胞/組織總RNA提取試劑盒（批號19221ES50）、Hifair Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（批號11141ES60）、Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批號11184ES08）購自上海翊圣生物科技有限公司；雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）抗體（批號WL00940）、β-catenin（批號WL0962a）、視網膜母細胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）抗體（批號WL02216）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號WL04004）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗體（批號WL01932）購自沈陽萬類生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗兔單克隆抗體（批號AS014）、β-actin抗體（批號AC026）購自愛博泰克生物技術公司。

1.4 儀器

311型CO2細胞培養箱、MK3型多功能讀板機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5418型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；E200型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ChemiDoc MP凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 丹參-赤芍藥對活性成分及靶點篩選 通過TCMSP數據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索丹參、赤芍的化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件篩選化學成分及對應蛋白靶點，并通過參考文獻進行補充[5]。使用UniProt（https://uniprot.org/）校正化學成分靶點基因名稱，使蛋白質靶點信息標準化[6]。

2.1.2 CRC相關基因查找及藥物-疾病交集基因獲取 通過GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://omim.org/）、PharmGkb（http:// www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd）、及DrugBank（https://go.drugbank.com/）數據庫，以“colorectal cancer”為關鍵詞進行疾病相關基因查找。將各數據庫得到的疾病相關基因進行并集并刪除重復基因，使用PERL軟件繪制Venn圖，對藥物預測潛在靶點與疾病相關靶點取交集，即獲得丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點。

2.1.3 中藥調控網絡及蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建 將丹參-赤芍的主要活性成分與潛在靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件中，繪制“中藥-活性成分-潛在靶點”網絡。將交集靶點輸入到STRING數據庫（https://string-db.org/），物種設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為最高置信度“highest confidence（0.9）”，得到PPI網絡，再運用Cytoscape 3.8.2軟件將PPI網絡做可視化處理。使用插件CytoNCA提取網絡中得分較高的節點，以介數和自由度的中位數作為截點，將截點之上的靶點視為關鍵靶點，并進行后續研究。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 應用R軟件中Bioconductor模塊軟件包“org.Hs.eg.db”運行完entrez ID轉換。采用R軟件中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”和“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”模塊對關鍵靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，過濾條件為＞0.05，輸出氣泡圖，分析富集結果。運行“pathview”模塊繪制通路圖[7]。

2.1.5 潛在活性成分與核心靶蛋白的分子對接 將藥物活性成分與關鍵靶點進行分子對接，首先通過PubChem數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）獲得化合物的3D結構，并利用Open Babel 2.3.2軟件將獲得的SDF文件轉化為PDB格式。從PDB數據庫（http://www.rcsb.org/pdb）獲得關鍵靶點的3D結構PDB格式，分子圖形系統PyMOL 2.5.1去除水分子和小分子配體。靶蛋白與化合物均使用AutoDockTools 1.5.6轉化為PDBQT格式。利用AutoDock Vina 1.1.2軟件Discovery Studio（DS，V2016）進行對接，對結果進行分析處理，分子對接構象的結合能越低，則結合構象越穩定，反映受體分子與配體之間結合的可能性越大。故對接結果只保留每對分子對接的結合能絕對值最高者。

2.2 體外實驗驗證

2.2.1 MTT實驗 收集處于對數生長期的HCT116細胞，以5×105/mL接種于96孔板中，細胞貼壁后加入不同質量濃度（125、250、500、1000、2000 μg/mL）的丹參-赤芍溶液，同時設調零孔（不接種細胞不含藥物）和對照孔（接種細胞不含藥物），置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），輕晃混勻，于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，輕晃混勻，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細胞抑制率。

細胞抑制率＝[(對照－調零)－(給藥－調零)]/(對照－調零)

2.2.2 劃痕實驗 將處于對數生長期的HCT116細胞以1×106/mL接種于6孔板中，待細胞貼壁后，用10 μL的槍頭在孔內劃線，用PBS緩沖液沿孔壁輕輕沖洗孔底2次，吸凈細胞殘渣，每孔加入2 mL不同質量濃度（100、200、400 μg/mL）的丹參-赤芍溶液后，置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養48 h，對照組加入不含藥物的培養基。培養0、48 h后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件計算劃痕面積。

2.2.3 qRT-PCR檢測、黏著連接蛋白β1（catenin beta 1，）和mRNA表達 按“2.2.2”項下方法處理細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物(5’-3’) ESR1F: CGCCTCTAACCTCGGGCTG R: AGTAGGGCCATCCCAGATGC CTNNB1F: CTGAGGAGCAGCTTCAGTCC R: GGCCATGTCCAACTCCATCA RB1F: GACTTCTACTCGAACACGAATGC R: GTGTCCACCAAGGTCCTGAG β-actinF: AGCGAGCATCCCCCAAAGTT R: GGGCACGAAGGCTCATCATT

2.2.4 Western blotting檢測ESR1、β-catenin、RB1、Caspase-3和PARP蛋白表達 按“2.2.2”項下方法處理細胞，收集各組細胞，加入適量RIPA裂解液，于冰上裂解，提取細胞總蛋白，于100 ℃水中加熱5～10 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，封閉2 h，分別加入相應一抗（1∶1000），室溫孵育1 h，4 ℃過夜孵育；洗膜后，加入二抗（1∶8000），室溫孵育1 h；洗膜后加入ECL發光液顯色，放置于凝膠成像系統運行程序顯影成像，應用Image J軟件分析條帶的灰度值。

3 結果

3.1 丹參-赤芍藥對活性成分及靶點的篩選

通過在TCMSP數據庫中查找到丹參-赤芍的活性成分并按照篩選條件進行篩選，得到活性成分206個，藥物作用靶基因352個。

3.2 CRC相關靶點篩選和藥物-疾病交集靶點獲取

將GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DurgBank數據庫檢索的CRC相關靶點結果合并，去除重復數據，篩選得到CRC相關靶點9143個，見圖1。將丹參-赤芍藥對的潛在靶點與CRC相關靶點取交集映射，利用Perl軟件繪制韋恩圖，共得到283個交集靶點，見圖2。

圖1 CRC相關靶點

圖2 丹參-赤芍藥對與CRC靶點的Venn圖

3.3 “中藥-活性成分-潛在治療靶點”網絡分析

將篩選后的丹參-赤芍活性成分、交集靶點以及中藥信息導入Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化分析，獲得“中藥-活性成分-潛在治療靶點”網絡圖，見圖3。

3.4 PPI網絡分析

將藥物與疾病共有靶點導入STRING數據庫，得到PPI網絡（圖4），共有131個節點、520條邊。使用插件CytoNCA提取網絡中得分較高的節點，以介數和自由度的中位數作為截點，根據條件選擇排名前11的靶點為ESR1、CTNNB1、RB1、特化蛋白1（specialized protein 1，SP1）、原癌基因SRC、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JUN）、信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、周期依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、細胞周期素D1（cyclin D1，CCND1），取排名前3的靶點即ESR1、CTNNB1、RB1作為關鍵靶點（圖5），進行后續研究。

藍色圓形代表丹參活性成分，紅色圓形代表赤芍活性成分，藍色方形代表潛在治療靶點

圓形節點表示每個基因對應的蛋白，節點間連接的直線表示2個蛋白有相互作用，線越粗表示作用關系越強

3.5 GO功能富集分析

根據R語言程序設定條件進行GO功能富集分析，富集結果按照值從小到大排序，選取前10條GO條目輸出氣泡圖。如圖6所示，丹參-赤芍藥對主要影響藥物反應、氧化應激響應等生物過程（biological process，BP），影響膜筏、膜微域等細胞組分（cellular components，CC），參與酰胺結合、肽結合等分子功能（molecular function，MF）。

圖5 排名前11的靶點

圖6 共同靶點GO功能富集分析

3.6 KEGG通路富集分析

分析藥物與疾病共同靶點進行KEGG通路富集分析，根據值進行排序，得到丹參-赤芍藥對治療CRC的相關通路30條，見圖7。通過分析氣泡圖結果并結合腫瘤相關通路研究可知，丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路上。

3.7 丹參-赤芍活性成分與關鍵靶點的對接

根據PPI分析結果，選取度值排名前3的靶基因（ESR1、CTNNB1和RB1）所編碼的靶蛋白（ESR1、β-catenin和RB1）與丹參-赤芍藥對的活性成分進行分子對接，結果顯示，丹參-赤芍藥對中活性成分黃芩苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷、二沒食子酸、異歐前胡素、異隱丹參酮、淚柏醇、鞣花酸等與關鍵靶點對接穩定（表2）。對結果進一步分析發現，芍藥內酯苷與ESR1結合能力較強，分別在LEU346、GLU353、ARG394形成H鍵，結合能為?67.481 kJ/mol；苯甲酰芍藥苷與β-catenin結合能力較強，分別在SER448、ARG474形成H鍵，結合能為?37.983 9 kJ/mol；苯甲酰芍藥苷與RB1結合能力較強，分別在LYS765、TYR756形成H鍵，結合能為?36.384 6 kJ/mol（圖8）。

圖7 共同靶點KEGG通路富集分析

表2 活性成分與ESR1、β-catenin和RB1的對接結合能

Table 2 Docking binding energy of active ingredients with ESR1, β-catenin and RB1

化合物CAS號化學式結合能/(kJ·mol?1) ESR1β-cateninRB1 黃芩苷21967-41-9C21H18O11?59.839 7?36.287 8?31.935 1 芍藥內酯苷39011-90-0C23H28O11?67.481 0?35.980 9?27.285 5 苯甲酰芍藥苷38642-49-8C30H32O12?43.502 0?37.983 9?36.384 6 木犀草素491-70-3C15H10O6?43.917 8?31.121 4?28.384 9 芍藥苷23180-57-6C23H28O11?57.785 0?36.094 9?34.370 7 二沒食子酸536-08-3C14H10O9?41.632 7?30.167 2?30.135 8 異歐前胡素482-45-1C16H14O4?40.261 3?26.367 9?24.423 8 異隱丹參酮22550-15-8C19H20O3?38.606 6?30.239 8?20.804 0 淚柏醇596-85-0C20H34O?38.050 1?29.017 5?24.494 1 鞣花酸476-66-4C14H6O8?41.694 3?28.035 6?20.353 2

A-芍藥內酯苷與ESR1對接；B-甲苯酰芍藥苷與β-catenin對接；C-甲苯酰芍藥苷與RB1對接

3.8 丹參-赤芍藥對抑制HCT116細胞增殖

如表3所示，不同質量濃度的丹參-赤芍對HCT116細胞均有一定的抑制作用，且呈劑量相關性。運用SPSS 25.0統計軟件計算出藥物作用于HCT116細胞48 h的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為459.303 μg/mL。根據IC50值和本課題組前期實驗，給藥質量濃度選擇在459.303 μg/mL以下。選擇100、200、400 μg/mL的丹參-赤芍進行后續實驗。

3.9 丹參-赤芍藥對抑制HCT116細胞遷移

如圖9所示，與對照組比較，各給藥組細胞遷移率顯著降低（＜0.05、0.01），其中丹參-赤芍高劑量組作用最佳。

表3 丹參-赤芍藥對對HCT116細胞活力的影響(, n= 3)

與對照組比較：**＜0.01

**< 0.01control group

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.10 丹參-赤芍藥對對HCT116細胞ESR1、CTNNB1和RB1 mRNA表達的影響

如圖10所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對各劑量組mRNA表達水平顯著降低（＜0.05、0.01），丹參-赤芍藥對高劑量組mRNA表達水平顯著降低（＜0.01），丹參-赤芍藥對中、高劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

3.11 丹參-赤芍藥對對HCT116細胞ESR1、β-catenin和RB1蛋白表達的影響

如圖11所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對各劑量組ESR1和β-catenin蛋白表達水平均顯著降低，RB1蛋白表達水平明顯升高（＜0.05、0.01）。

圖10 丹參-赤芍藥對對HCT116細胞ESR1、CTNNB1和RB1 mRNA表達的影響(, n = 3)

3.12 丹參-赤芍藥對HCT116細胞凋亡蛋白表達的影響

如圖12所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對高劑量組Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），丹參-赤芍藥對中、高劑量組PARP蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖11 丹參-赤芍藥對對HCT116細胞ESR1、β-catenin和RB1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖12 丹參-赤芍藥對對HCT116細胞凋亡蛋白表達的影響(,n = 3)

4 討論

中醫認為CRC病位在大腸，與脾胃密切相關。《靈樞·百病始生》提到：“腸胃之絡傷，則血溢于腸外，腸外有寒，汁沫與血相摶，則并合凝聚不得散，而積成矣。”患者多因脾失健運，血行不暢，日久致瘀，瘀血搏結腸道，損傷腸絡，日久成癰而致癌腫，常見腹痛拒按、舌質紫暗或有瘀斑、脈澀等臨床表現，故臨床治療CRC多加入丹參、赤芍等活血類中藥[8]。

本研究利用網絡藥理學，深入挖掘丹參-赤芍治療CRC的有效成分、潛在靶點和作用機制。共篩選到丹參-赤芍藥對的活性成分206個，丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點283個，并通過PPI網絡分析篩選出ESR1、CTNNB1及RB1為關鍵核心靶點。其中，ESR1是CRC發生、發展和轉移中最重要的調節基因，是誘導CRC的潛在機制[9]。一項基于GSCA的遺傳改變分析表明，基因的突變可能是誘發CRC致癌的潛在機制，并且與生物學進展與免疫反應有關[10]。CTNNB1基因編碼蛋白β-catenin是Wnt信號傳導的關鍵組成部分，在CRC進展中起著至關重要的作用[11-12]。β-catenin在正常結直腸上皮組織中定位于細胞膜，而在癌變過程中β-catenin從細胞膜游離，在CRC癌組織中主要表達于細胞質和細胞核中。其在CRC癌組織中異常高表達與腫瘤的分化、侵襲、轉移密切相關[13]。研究顯示，槲皮素、木犀草素、芹菜素等中藥單體通過Wnt/β-catenin通路對CRC的不同階段（包括癌前病變、CRC早期和晚期）發揮抗腫瘤作用[14]。β-catenin可能是CRC患者的臨床預后的重要生物標志物。RB1是腫瘤抑制基因，RB1表達水平與腫瘤的大小、淋巴結轉移及臨床預后密切相關，RB1可以通過限制細胞周期進展從而抑制腫瘤的發展進程[15]。有研究發現RB1在前列腺癌、乳腺癌、CRC、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤進展過程中失活[15-18]。腫瘤細胞中的RB1缺失會誘導脂肪酸氧化并激活JNK，激活后的JNK通過刺激IL-6的產生，進而促進STAT3介導的干細胞樣行為和惡性進展。也有研究分析發現，RB1是CRC發生晚期肝轉移及腹膜轉移的核心基因，并且可能與腫瘤浸潤淋巴細胞相關途徑有關[19]。本研究通過MTT及劃痕實驗驗證了丹參-赤芍藥對對HCT116細胞的增殖和遷移能力具有明顯的抑制作用，并且通過qRT-PCR及Western blotting實驗分別在基因和蛋白水平驗證了丹參-赤芍藥對對網絡藥理學篩選出的核心基因ESR1及CTNNB1（編碼蛋白β-catenin）的表達具有明顯的抑制作用，對RB1表達具有明顯的促進作用。因此，核心基因ESR1、CTNNB1及RB1有可能在丹參-赤芍藥對抑制CRC發生發展過程中發揮了關鍵作用。

GO功能富集分析發現丹參-赤芍藥對對藥物反應、氧化應激等BP，膜筏、膜微域等CC，酰胺結合、肽結合等MF產生影響，并且KEGG通路富集分析得到丹參-赤芍藥對主要通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路抑制CRC的發生發展。其中PI3K/Akt是與腫瘤發生發展密切相關的信號通路，在調控CRC細胞增殖、侵襲、細胞周期等行為上發揮重要的作用。研究表明，HER2在CRC癌組織中的高表達水平與PI3K/Akt通路的激活有關，PI3K可以驅動HER2的表達，促進腫瘤干細胞增殖能力[20]。杠柳次苷是一種潛在的抗癌化合物，研究發現杠柳次苷可以通過靶向PI3K/Akt通路，促進細胞凋亡來發揮抗CRC作用[21]。TNF-α是CRC中常見的促炎細胞因子，可通過激活JNK信號通路調節BaP和PhIP誘導的CRC上皮細胞DNA損傷。TNF-α誘導的DNA損傷又能被功能性p53抑制[22]。CRC中增強的糖酵解和磷酸戊糖途徑與HIF-1α表達增加有關，活性氧（reactive oxygen species，ROS）/ PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號激活HIF-1α誘導的代謝重編程，從而在CRC治療過程中促進機體對5-氟尿嘧啶產生耐藥性，降低臨床療效[23]。故PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等信號通路與CRC的發生發展密切相關。

利用分子對接技術篩選出丹參-赤芍藥對中有效成分黃芩苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷等與關鍵核心靶點對接能力較強，這與本課題組前期進行的UPLC-Q-TOF/MF實驗篩選出的藥物有效成分相一致[4]。其中，黃芩苷介導了多種癌癥相關信號通路的調節[24]，其可以通過上調孕酮誘導的蛻膜蛋白（decidual protein induced by progesterone，DEPP）和激活Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MEK）/細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號傳導誘導CRC細胞的衰老[25]，也可以通過減少c-Myc的表達來誘導CRC細胞凋亡并抑制腫瘤生長[26]；芍藥內酯苷可通過核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）信號通路抑制潰瘍性結腸炎大鼠發生炎癥反應，抑制結腸組織氧化反應，減輕結腸組織病變，從而阻斷CRC“炎-癌”轉化進程[27]；苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷等也具有很好的抗腫瘤活性作用[28-30]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學、分子對接技術及體外實驗證明了丹參-赤芍藥對能夠通過多通路、多靶點在CRC治療中發揮重要的作用，為丹參-赤芍藥對治療CRC提供了客觀依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofet-drug pair in treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and molecular docking

WANG Fang-yuan1, WANG Dong1, KONG Xian-bin2, SHI Hao-yang1, ZHAO Shuang1, YANG Yu-ying1,MENG Jing-yan2

1. Graduate School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301600, China 2. College of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301600, China

To explore the mechanism of Danshen (et)-Chishao () drug pair in treatment of colorectal cancer (CRC), and further verified by icell experiments.Active ingredients ofet-drug pair and corresponding targets were screened out through TCMSP, targets related to CRC were obtained by GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD and DrugBank databases, CRC-related targets were obtained by searching GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD and DrugBank databases. Active ingredients targets ofet-drug pair were intersected with CRC targets, Cytoscape 3.8.2 software was used to construct “drug-active ingredient-disease-target” network, STRING database was used to construct protein-protein interaction (PPI) network, R language was used for gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis; Key targets and core active components were selected, and AutoDock software was performed for molecular docking. The results of network pharmacology were verified bycell experiments. MTT and scratch experiments were used to detect the effects ofet-drug pair on proliferation and migration of HCT116 cells. qRT-PCR and Western blotting were used to detect the effect ofet-drug pair on network pharmacology core targets expression.Network pharmacology prediction showed 206 active ingredients ofet-drug pair, with a total of 352 corresponding target and 9143 CRC-related targets, and 283 intersecting targets were obtained. Three key therapeutic targets ofet-drug pair in treatment of CRC were identified by PPI network screening: estrogen receptor 1 (ESR1), catenin β1 (CTNNB1) and retinoblastoma 1 (RB1). GO function and KEGG pathway analysis showed that key targets involved phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-protein kinase B (Akt) signaling pathway, tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway, p53 signaling pathway, hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), apoptosis, etc. Molecular docking results showed that key targets and important active components were bound in a stable conformation. The core active components ofet-drug pair in treatment of CRC were mainly baicalin, paeoniflorin and benzoylpaeoniflorin. MTT and scratch experiments showed thatet-drug pair significantly inhibited the proliferation and migration of HCT116 cells (< 0.05, 0.01), significantly inhibited mRNA expression levels ofand(< 0.05, 0.01), up-regulatedmRNA expression level (< 0.05), down-regulated ESR1, β-catenin, cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3) and poly-ADP-ribose polymerase (PARP) protein expressions (< 0.05, 0.01), up-regulated RB1 protein expression level (< 0.05, 0.01).et-drug pair may act on ESR1, CTNNB, RB1 and other targets, and inhibit the proliferation and migration of CRC cells through PI3K-Akt signaling pathway, TNF signaling pathway, p53 signaling pathway, HIF-1 signaling pathway and other related pathways, thereby inhibiting the proliferation and migration ability of CRC cells.

et-drug pair; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking; experimental verification; estrogen receptor 1; catenin β1; retinoblastoma 1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5731 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.016

2022-07-21

國家自然科學基金資助項目（81973728）；天津市自然科學基金資助項目（18JCZDJC36600）

王方園，在讀博士研究生，研究方向為中醫藥抗腫瘤的基礎研究。E-mail: 18132398088@163.com

孟靜巖，博士生導師，教授，研究方向為中醫藥抗腫瘤的基礎研究。E-mail: mengjy@163.com

[責任編輯 李亞楠]