EMS處理對黃花美冠蘭原球莖生長及分化的影響

鄧小果

(海南開放大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村學(xué)院，海南 海口 570208)

黃花美冠蘭(Eulophia flava(lindley)Hookerf.)是一種觀賞價值很高的野生蘭科植物，其花葶側(cè)生，粗壯，高可達(dá)1m；總狀花序直立，長28～32cm，疏生10余朵花；單花輪生，每節(jié)著生3朵小花，節(jié)間距1.5cm左右；花大，黃色，直徑達(dá)4cm以上；花期5—6月。早在1987年，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院在海南島花卉種質(zhì)資源考察中，就將黃花美冠蘭列為重點推薦的野生蘭種類[1]，引入海南熱帶植物園馴化栽培。黃花美冠蘭的組織培養(yǎng)[2]、核型分析[3]、切花保鮮[4]都有相關(guān)的研究。

化學(xué)誘變育種是用化學(xué)誘變劑處理植物材料，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變，從而引起形態(tài)特征的變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)，對這些變異進(jìn)行鑒定、培育和選擇，最終育成新品種，成本低、操作簡單，能夠產(chǎn)生常規(guī)育種方法難以獲得的新基因和新性狀[5,6]。目前化學(xué)誘變主要應(yīng)用于對農(nóng)作物的處理，再通過多世代對突變體進(jìn)行選擇和鑒定，直接或間接地培育成生產(chǎn)上能利用的農(nóng)作物品種[7-9]。

觀賞植物在化學(xué)誘變中大多采用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體[10-13]，蝴蝶蘭[14]、文心蘭[15]EMS離體化學(xué)誘變技術(shù)有相關(guān)報道，黃花美冠蘭EMS的離體化學(xué)誘變研究尚未見報道。本試驗采用組織培養(yǎng)與化學(xué)誘變技術(shù)相結(jié)合，通過液體浸泡法將不同濃度的EMS對黃花美冠蘭原球莖作不同時間處理，經(jīng)EMS處理后的原球莖再分化成苗。與傳統(tǒng)雜交育種選育，大大減輕了工作量，加快了選育進(jìn)程，拓寬了黃花美冠蘭新品種選育的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為海南大學(xué)提供的健壯的黃花美冠蘭原球莖。

1.2 誘變劑及培養(yǎng)基

1.2.1 誘變劑

EMS(甲基磺酸乙酯)為瑞士生產(chǎn)，將帶有刻度的燒杯和無菌水在121℃(1.1kg·cm-1)下滅菌30min，在超凈工作臺上用過濾滅菌器將EMS原液配成濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 5種濃度的溶液，隨用隨配。

1.2.2 培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基：MS加BA 3.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加10%CM加AC 1g·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1；分化培養(yǎng)基：MS加BA 3.0mg·L-1加NAA 0.1mg·L-1加土豆50g·L-1加AC 1g·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1。

1.3 方法

1.3.1 EMS處理

選取生長旺盛，大小基本均勻的黃花美冠蘭原球莖，在超凈工作臺上用鑷子將其單個剝離，用不同濃度EMS的進(jìn)行處理。EMS處理濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。處理時間為4h、6h、8h，處理后用無菌水沖液沖洗3～5次；以無菌水處理作為對照。

1.3.2 處理材料的培養(yǎng)

將處理后的原球莖接到增殖培養(yǎng)基中，每個處理接種40個原球莖，每個處理重復(fù)3次，所有材料均在同一條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度26±1℃，每天光照12h，30d后統(tǒng)計死亡率。培養(yǎng)過程中觀察原球莖的生長情況。

死亡率(%)=死亡原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

1.3.3 原球莖分化

將繼代后存活的原球莖繼續(xù)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度26±1℃，每天光照12h，30d后觀察生長情況并統(tǒng)計分化率。

分化率(%)=分化成芽原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)×100%

1.3.4 EMS對黃花美冠蘭微核的影響

1.3.4.1 試驗方法

濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的EMS溶液；時間為4h、8h。對照(CK)不含EMS。

取接種3d后正處于生長旺盛期的原球莖，于4℃冰箱中，用卡諾氏固定劑(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1v/v)固定24h。置70%乙醇中保存。

1.3.4.2 染色制片

在室溫中用改良石灰酸品紅染液染色，常規(guī)壓片法制片。統(tǒng)計微核率。

MCN(%)=觀察到的MCN數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS對黃花美冠蘭原球莖生長的影響

將原球莖放入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%不同濃度的EMS濃度中浸泡4h、6h、8h后，接種到增殖培養(yǎng)基中，結(jié)果如表1。

各處理所得的原球莖死亡率在經(jīng)過反正弦角度代換在SAS系統(tǒng)上進(jìn)行鄧肯比較。得出，F(xiàn)=442.86，P<0.01，表明處理間的差異達(dá)極顯著。由表1可知，不同EMS濃度及處理時間對原球莖的存活有很大的影響。在EMS處理黃花美冠蘭原球莖過程中，隨著EMS處理濃度增大，處理的材料生理損傷較大，材料出現(xiàn)褐化，白化現(xiàn)象。經(jīng)過EMS處理的原球莖早期生長緩慢，14d后部分原球莖逐漸出現(xiàn)白化或褐化現(xiàn)象，并逐漸死亡。對照原球莖無白化現(xiàn)象，經(jīng)EMS誘變后的死亡率明顯高于對照組，在相同的處理時間內(nèi)，隨EMS濃度升高原球莖的死亡率升高明顯。相同濃度的長時間處理，死亡率明顯增加。在濃度為1.0%，處理時間為8h時，原球莖全部死亡。高濃度需要較短處理時間就可使原球莖致死，低濃度需要較長處理時間。

表1 黃花美冠蘭經(jīng)EMS處理后死亡率的方差分析

圖1 經(jīng)EMS處理后受損傷的原球莖

2.2 EMS處理對原球莖芽的分化的影響

將EMS處理過的原球莖轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，15d后，原球莖分化出芽，EMS對芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生較大的影響。各處理所得的原球莖分化率在經(jīng)過反正弦角度代換在SAS系統(tǒng)上進(jìn)行鄧肯比較。得出，F(xiàn)=669.24，P<0.01，表明處理間的差異達(dá)極顯著。

由表2可知，處理時間長的分化率低于處理時間短的分化率。在相同的處理時間內(nèi)，隨著EMS濃度的增加，原球莖的分化率普遍呈現(xiàn)下降趨勢。在EMS處理相同的濃度下，所有處理組合的原球莖分化率都是隨著EMS處理時間的升高而降低。除了在處理濃度為0.4%時，時間為4h和6h下的原球莖分化率比EMS濃度為0.2%時的高。

表2 黃花美冠蘭原球莖經(jīng)EMS處理后分化率的方差分析

2.3 EMS處理原球莖后對細(xì)胞核的影響

EMS誘發(fā)黃花美冠蘭原球莖的細(xì)胞微核率及其統(tǒng)計結(jié)果如表3。各組所得微核百分率在經(jīng)過反正弦角度代換在SAS系統(tǒng)上進(jìn)行鄧肯比較。得出F=165.55，P<0.01。處理間的差異達(dá)到極顯著。從表3可以看出，對照沒有出現(xiàn)微核，用EMS處理過的原球莖都能產(chǎn)生微核，當(dāng)處理時間相同時，在0%～1.0%范圍內(nèi)，隨著濃度升高，原球莖細(xì)胞微核率提高，當(dāng)濃度相同時，隨著時間的延長，原球莖細(xì)胞微核率也提高，最高微核率出現(xiàn)在濃度為0.8%，處理時間為8h中，最低微核率出現(xiàn)在對照組中。本試驗中觀察到的微核主要以單微核居多，也出現(xiàn)雙微核。微核的出現(xiàn)是由于上次有絲分裂過程中染色體受損形成的斷片或染色體活動異常而造成的。

表3 EMS對黃花美冠蘭原球莖細(xì)胞微核數(shù)的誘變效應(yīng)

圖2 EMS處理原球莖后產(chǎn)生的細(xì)胞微核

3 討論與結(jié)論

本試驗將原球莖放入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%等不同濃度的EMS濃度中浸泡4h、6h、8h后，接種到增殖培養(yǎng)基中，觀察原球莖的生長情況和分化率。在培養(yǎng)過程中，原球莖的死亡率隨著濃度和時間的增加而增加，在濃度為0.4%處理時間為4h、6h，原球莖的分化率較好，說明原球莖在受損傷后，又恢復(fù)生長，其中可能包含較多的突變細(xì)胞。濃度為0.4%處理時間為8h和濃度為0.6%處理時間為6h時，原球莖的死亡率分別為52.91%和57.77%，約為對照50%，可作為創(chuàng)造黃花美冠蘭PLB突變體的參考濃度。通過對處理過的原球莖進(jìn)行細(xì)胞學(xué)上的觀察，發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)胞都出現(xiàn)了微核。

目前誘變的主要目的是獲得變異體，對于組培誘變體系的控制方向和定性、定量研究方面，目前開展的試驗較少；變異性狀是否有利尚有待于后期的檢驗和鑒定，變異體有效鑒定方法的研究也有待于進(jìn)一步研究和完善。因此，如何控制誘變方式和技巧以實現(xiàn)變異性狀的定向控制還需要深層次的研究。