益康膠囊微生物限度檢查方法適用性研究

微生物限度檢查是保障藥品使用安全有效的一項重要參數

，《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2020年版四部

明確提出對供試品進行微生物限度檢查時所選方法應進行適用性試驗，從而避免方法缺陷造成的漏檢、誤判

。中藥制劑由于組方藥味成分及其相互作用機理復雜， 很多制劑有抑菌作用，進行方法適用性試驗對保證檢測方法的科學性和嚴謹性尤為重要

。益康膠囊是由人參、黃芪、丹參等十三味藥組成的中藥復方制劑，具有調節全身代謝，扶正固本等功效，臨床上用于治療冠心病、高脂血癥等

。據報道，處方中的黃芪、黃精、丹參等藥味均具有一定的抑菌活性

。為保證檢驗結果真實反映樣品中微生物實際污染程度，筆者按照《中國藥典》

2020年版四部通則1105，1106，1107 要求， 采用3 批樣品進行3 次獨立試驗開展方法適用性研究，以期建立益康膠囊的微生物限度檢查方法。

根據研究目的的需要，選擇了局部空間自相關的方法，對福州市區域經濟差異進一步分析。局部自相關作為空間自相關的一種，是反映每個區域與周邊地區之間同一屬性值的相似性，用來驗證局部區域存在的空間異質性。通常用空間聯系的局域指標(LISA)和Moran散點圖等進行度量[6]。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

JE1201 電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；MLS-3781L-PC 型高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫療器械株式會社）；BPH-9272 精密恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅱ電熱恒溫培養箱 （上海新苗醫療器械制造有限公司）；BSC-1300ⅡA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；WGZ-2XJ 型濁度計（上海昕瑞儀器儀表有限公司）。

[20]Indeed,in herculean preparation and glitzy execution,the summit was reminiscent of the Games six years ago,with schools,offices and factories closed to combat the smog,and a similarly spectacular fireworks display over Beijing’s Olympic Park.

1.2 培養基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養基（tryptic soy agar，TSA），胰酪大豆胨液體培養基（trypsin soy broth，TSB），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（sabouraud dextrose agar，SDA），沙氏葡萄糖液體培養基 （sabouraud dextrose broth，SDB），腸道菌增菌液體培養基，麥康凱液體培養基，麥康凱瓊脂培養基，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基，RV 沙門菌增菌液體培養基， 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基，均由北京陸橋技術股份有限公司提供。培養基經過適用性檢查，符合《中國藥典》2020年版四部

規定。0.9%無菌氯化鈉溶液（氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；按藥典要求配制、滅菌）。

濕式誘捕器投放高度20、40、60 cm處理誘捕茶尺蠖成蟲總量分別為321、158和148頭，平均每臺為 80.25、39.50 和 37.00 頭，可見高度 20 cm 處理誘捕量最多，并與其他2個處理均達到顯著差異，高度40和60 cm處理誘捕效果相當，因此，濕式誘捕器在茶園的最優投放高度為20 cm。

1.3 菌種

供試品對照組：取“2.1”項下1∶10 供試液9.9 ml，加入TSB 0.1 ml，混勻，取其1 ml 注入直徑90 mm 的無菌平皿，平行制備2 個平皿。

1.4 供試品

按照《中國藥典》2020 版四部

對菌種的培養要求進行菌液制備。將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉制備成每1 毫升含菌落數為5000～10 000 cfu 的菌懸液， 用于微生物計數；將銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌制備成每1 毫升不大于100 cfu 的菌懸液， 用于控制菌檢查。

2.5.1 陽性對照組 大腸埃希菌檢查取“2.1”項下1∶10供試液10 ml； 耐膽鹽革蘭陰性菌取1 ml，0.1 ml，0.01 ml 的預培養物（“2.1”項下1∶10 供試液23℃培養2 h），沙門菌取“1.4”項下供試品10 g；上述供試液分別加入“2.2”項下用于控制菌檢查的對應菌液，接種至對應的規定培養基，混勻，33℃培養24 h。

2 方法與結果

2.1 供試液制備

取“1.4” 項下供試品10 g， 加入TSB 至100 ml，45℃水浴保溫振蕩15 min，制成1∶10 的供試液；取1∶10的供試液適量，加入TSB 依法制成1∶20、1∶50 供試液

。

2.2 試驗菌液制備

益康膠囊，陜西君碧莎制藥有限公司，規格：每粒裝0.4 g（含維生素E 33.3 mg），批號：20201121，20210612，20210918。

2.3 計算與結果判斷

按照《中國藥典》2020年版四部

規定。

2.4 計數方法適用性試驗

2.4.3 需氧菌總數[平皿傾注法（1∶20）]試驗組、供試品對照組和菌液對照組的制備：除將“2.4.1”項下1∶10 供試液更換為1∶20 供試液外， 其他操作步驟同“2.4.1”項下，試驗結果詳見表2。由表2 可見，采用平皿傾注法（1∶20）進行需氧菌總數方法適用性試驗時，各試驗菌株回收比值均在0.5～2 范圍內，表明該方法可行。

銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌，以上菌種英文名稱及編號均與《中國藥典》2020年版四部

要求相符。均來源于廣東環凱微生物科技有限公司，經復蘇傳代并鑒定合格，本次試驗所用菌種均為第4 代。

菌液對照組：取TSB 9.9 ml，按試驗組操作加入5種試驗菌液各0.1 ml（菌落數為5000～10 000 cfu/ml），進行菌種回收試驗。

試驗結果：稀釋濃度為1∶20 時，枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.91、0.78、0.82； 稀釋濃度為1∶50時，其回收比值分別為0.90、0.84、0.79。由以上數據可知，兩個稀釋濃度回收比值較為接近，當兩個稀釋濃度回收比值均符合要求時， 宜選取較低稀釋濃度，因此需氧菌總數計數可采用平皿傾注法（1∶20）。

以上各組平皿，按照《中國藥典》2020年版四部

要求注入15～20 ml 相對應的SDA 或TSA，測定各平皿菌落數，計算各試驗菌回收比值，結果詳見表1。由表1 可知，需氧菌總數采用平皿傾注法（1∶10），枯草芽孢桿菌回收比值小于0.5， 霉菌和酵母菌總數各試驗菌回收比值均在0.5～2 范圍內。表明益康膠囊對枯草芽孢桿菌有抑菌活性，其霉菌和酵母菌總數可采用平皿傾注法（1∶10）。

2.4.2 需氧菌總數（預試驗） 以枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，采用平皿傾注法（1∶20，1∶50）對需氧菌總數重新開展試驗。取“2.1”項下1∶20，1∶50 供試液各9.9 ml，試驗菌液取“2.2”項下枯草芽孢桿菌菌懸液0.1 ml，使每1 ml 供試液含菌量不大于100 cfu，其余照“2.4.1”項進行試驗。

學者錢鐘書也是個善于“偷”時間的人。他從來不參加應酬，不論再高規格、再有面子的飯局，也照拒不誤，因為在他眼里，在飯桌上浪費時間，揮霍生命，是世上最愚蠢的事情。他把這些時間都偷來著書立說，鉆研學問，成了大學者。

2.4.1 需氧菌總數、 霉菌和酵母菌總數[平皿傾注法（1∶10）]試驗組：取“2.1”項下1∶10 供試液分裝于無菌試管中，每管9.9 ml，分別加入“2.2”項下用于微生物計數的5 種試驗菌液0.1 ml，混勻，取上述混合液各1 ml 注入直徑90 mm 的無菌平皿中， 每種試驗菌平行制備2 個平皿。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

按照《中國藥典》2020年版四部

要求，益康膠囊控制菌檢查應為大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌3 種。

冬季參加體育鍛煉，戶外活動最好選在廣場、樹林、草地、空氣清新潔凈的地方，便于機體在鍛煉時吸入更多新鮮空氣；避免在車輛、行人較多的道路旁和大霧天鍛煉，減少尾氣和煙塵對呼吸系統的影響；同時要注意選擇相對松軟的場地，避免場地堅硬對腳、腿、關節、骨骼的傷害。在室內進行鍛煉時，一定要保持室內空氣的流通。因為，人在安靜狀態下每小時呼出的二氧化碳有20多升。若十多個人同時進行鍛煉，一小時就是200升以上，再加上汗水的分解產物，消化道排除的不良氣體等，會致使室內空氣受到嚴重污染。人在這樣的環境中會出現頭昏、疲勞、惡心、食欲不振等現象，鍛煉效果自然不佳。

2.5.2 供試品組 大腸埃希菌、 耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門菌供試液同“2.5.1”項下，均不加試驗菌液，其他同相對應的陽性對照組操作步驟分別制備供試品組。

2.5.3 陰性對照組 上述3 種控制菌檢查，均取稀釋劑代替供試液，其他同相對應的供試品組，制備陰性對照組。

2.5.4 試驗結果 按照《中國藥典》2020年版四部

規定進一步選擇和分離培養， 如果陽性對照組生長良好，表明益康膠囊對該菌無抑菌活性，方法成立；如果無菌落生長，表明樣品對該菌有抑菌活性，則需采用增加培養基體積等適宜的方法去除其抑菌活性后重復上述試驗，結果見表3。由表3 可見，陽性對照組均生長良好，供試品組和陰性對照組均無菌落生長，表明益康膠囊可以采用常規培養基體積進行控制菌檢查。

本文分析由制造商主導的Stackelberg博弈的均衡解，制造商主導的Stackelberg博弈的分散決策順序如下：

3 討論

3.1 建立方法適用性試驗遵循的原則

方法適用性試驗的本質是建立對樣品影響更小、操作效率更高的方法

，去除樣品抑菌性是其中的重點和難點

，設計試驗方案時應遵循由簡到繁，由單一到聯合的原則，采取循序漸進的方式逐步開展。本研究采用平皿傾注法（1∶10）進行微生物計數時，霉菌和酵母菌總數各試驗菌株回收比值均在0.5～2 范圍內； 需氧菌總數計數中枯草芽孢桿菌回收比值小于0.5，遂采用增加稀釋倍數重新進行試驗，采用平皿傾注法（1∶20）時，需氧菌總數計數5 種試驗菌株回收比值均在0.5～2 范圍內；進行控制菌檢查時，采用常規培養基體積對益康膠囊進行方法適用性試驗，結果陽性對照組均生長良好，陰性對照組均無菌落生長，表明該方法可靠有效。

3.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查預培養

耐膽鹽革蘭陰性菌泛指能夠在結晶紫中性紅膽鹽培養基上生長的微生物， 例如腸桿菌科的細菌，產氣單胞菌屬和假單胞菌屬都屬于這一類

。該項檢查為了使供試品的受損細菌充分恢復但不增殖，需要對1∶10 供試液進行預培養（約2 h）。此時，不能將試驗菌液加入1∶10 供試液進行預培養， 適宜的培養條件會導致試驗菌株的增殖，可能產生錯誤的試驗結果。

3.3 小結

通過方法適用性試驗，本研究建立了益康膠囊的微生物限度檢查方法： 需氧菌總數采用平皿傾注法（1∶20），霉菌和酵母菌總數采用平皿傾注法（1∶10）；控制菌檢查采用常規培養基體積。該方法有效可行，重現性好，可為藥品生產企業及相關檢驗機構開展益康膠囊的微生物限度檢查工作提供參考。

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